急性髓系白血病M2型CD33+/CD34-细胞aptamers的筛选及结构分析

论文摘要

背景与目的：急性髓系白血病（acute myeloblastic leukemia, AML）的诊断和分型,目前主要依据细胞形态学（Morphology, M）、免疫学（Immunology, I）、细胞遗传学（Cytogenetics, C）和分子生物学（Mole-cular Biology, M）相结合的MICM方法。但该方法仍不尽如意,存在不足之处。其主要原因是因为对AML发生与发展的机制,尤其是对白血病细胞特异性分子标记尚不十分清楚。近年来,随着指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技术的发展和改进,筛选与肿瘤细胞相结合的特异性核酸适体（aptamer）,并将其作为肿瘤分子诊断的特异性分子标记物已日益受到重视。然而,有关白血病细胞特异性的aptamer仍所知甚少。为此,本研究采用细胞SELEX（cell-SELEX, C-SELEX）技术筛选特异性识别AML-M2型白血病CD33+/CD 34-细胞的aptamer,为AML分子诊断提供基础。方法：首先,合成两端含有固定序列、中间为随机序列的单链DNA（single strand deoxyribonucleic acid, ssDNA）文库,然后,以AML-M2型白血病CD33+/CD34-细胞为靶细胞,正常人CD33+/CD34-细胞为反筛选细胞,采用C-SELEX技术,体外反复筛选ssDNA文库的aptamer,并用PCR技术将其扩增生成次级ssDNA文库。在此期间,采用荧光标记引物PCR扩增,流式细胞术分析次级文库ssDNA文库aptamer的富集度。最后,克隆最终轮次的次级ssDNA文库。测序后,分析各aptamer的一级及二级结构。结果：每轮筛选扩增的次级ssDNA文库经琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示清晰的DNA条带。经过13轮筛选,次级ssDNA文库与靶细胞结合的荧光强度从2.14%增加到51.12%,至第13轮趋于饱和,达到稳定状态。克隆后,挑选30个克隆子进行序列测定。分析结果显示,在其一级结构中含有AAGTA、TATCT、AGATG和AAATT四个保守序列,但8个aptamer无此保守序列,二级结构分析获得四种茎环、凸环模拟结构。结论：采用C-SELEX技术,本研究成功筛选到与AML-M2型白血病CD33+/CD34-细胞特异性结合的aptamer,为今后进一步深入研究aptamer的特性以及白血病分子诊断提供了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验对象
• 1.1.2 主要试剂及配制
• 1.1.3 实验仪器
• 1.1.4 单链脱氧寡核苷酸ssDNA随机文库及引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 单个核细胞分离
• +/CD34^-细胞的分选'>1.2.2 CD33⁺/CD34^-细胞的分选
• +/CD34^-细胞纯度分析'>1.2.3 CD33⁺/CD34^-细胞纯度分析
• 1.2.4 aptamer筛选
• 1.2.5 aptamer富集度检测
• 1.2.6 aptamer克隆与测序
• 1.2.7 aptamer结构分析
• 第二章 实验结果
• +/CD34^-细胞纯度及回收率'>2.1 CD33⁺/CD34^-细胞纯度及回收率
• 2.2 aptamer筛选结果
• 2.3 aptamer富集度
• 2.4 aptamer克隆与测序结果
• 2.5 aptamer一级结构
• 2.6 aptamer二级结构
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢