论文摘要
背景:缺血后处理是指在一个持续时间较长的缺血期后,在再灌注前交替实施短时间的再灌注和停止再灌注。缺血远隔后处理是指在非缺血器官交替实施短时间的缺血和再灌注。近年来,缺血后处理和缺血远隔后处理抗缺血-再灌注损伤的器官保护效应已经被中外学者所证实。纳洛酮是临床麻醉中用于拮抗阿片类药物的常用药物,虽然其神经保护作用早已被证实,但目前尚不明确其是否具有抗脑缺血-再灌注损伤的后处理作用。有鉴于此,我们设计了本实验,旨在观察缺血后处理、缺血远隔后处理和纳洛酮后处理是否具有神经保护作用及其各种后处理措施之间的相互作用。另外,通过蛋白印迹分析,判断各种后处理措施的神经保护作用与MAP2表达的相关性;通过激光扫描共聚焦显微镜检查,进一步研究了各种后处理条件下大脑微循环结构的变化。方法:将134只成年雄性SD大鼠（270～330g）随机分为8组（Ⅰ-Ⅱ组,n=19;Ⅲ-Ⅷ组,n=16）,具体实验方案如下:Ⅰ组为假手术组,其余各组接受90 min的右脑局部缺血（MCAO）和24 h的再灌注。Ⅱ组为缺血对照组;Ⅲ组为缺血后处理组,再灌注开始后,Ⅲ组首先实施重复3次的30 s再缺血和30 s再灌注;Ⅳ组为缺血远隔后处理组,在再灌注前实施5 min的右股动脉缺血;Ⅴ组为缺血后处理和缺血远隔后处理复合应用组,实施Ⅲ组和Ⅳ组的两种后处理操作;Ⅵ组为小剂量纳洛酮后处理组;Ⅶ组为大剂量纳洛酮后处理组;Ⅷ组为缺血、缺血远隔和大剂量纳洛酮复合后处理组,实施Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅶ组的三种后处理操作。在再灌注即刻,大鼠腹腔注射用生理盐水稀释的纳洛酮10ml（Ⅵ组1 mg/kg,Ⅶ和Ⅷ组10 mg/kg）或等容生理盐水（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组）。本实验采用线栓法建立大鼠的局灶性脑缺血-再灌注损伤模型,即在颈总动脉（CCA）分叉下方1 cm处,将尼龙线栓置入CCA,经分叉上行进入颈内动脉（ICA）遇明显阻力表明线栓头端已进入大脑中动脉（MCA）起始处。开始计时大脑中动脉阻断（MCAO）诱发的局灶性脑缺血,90 min后缓慢抽出尼龙线栓,并开始再灌注计时。缺血远隔后处理采用单侧下肢缺血模型,在开始再灌注前5 min阻断单侧股动脉,在再灌注即刻松开股动脉夹。实验动物的排除标准包括:HBG低于80 g/L;SO2低于90%;迷走神经损伤;手术操作失败;MAP低于60 mmHg;蛛网膜下隙出血;尼龙线栓置入失败或刺破血管;术后24 h内感染和死亡。实验过程中连续监测心率（HR）、平均动脉压（MAP）和Ⅱ导联心电图（ECG）;在再灌注1 h后抽取动脉血进行血气分析。再灌注2 h和24 h后采用四分法测定大鼠的神经功能缺损评分（neurologic deficit score;NDS）:0级,无神经功能缺损症状;1级,轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空时不能伸展左前肢;2级,中度局灶性神经功能缺损,即行走时向左侧偏转;3级,重度局灶性神经功能缺损,即行走时向左侧倾倒;4级,昏迷,不能自发行走。实验结束后断头取脑,采用TTC染色法测定脑梗死面积（以其同侧大脑半球面积的百分比表示）（n=10）,采用蛋白质斑迹技术测定双侧脑组织的MAP2表达（n=3）。在再灌注24 h后,每组的另外3只大鼠在股静脉注射异旒氰酸-右旋糖酐1 ml,1 min后快速断头取脑,进行激光扫描共聚焦显微镜检查。在再灌注即刻,Ⅰ组和Ⅱ组另外的3只大鼠,静脉注射异旒氰酸-右旋糖酐1 ml用于激光扫描共聚焦显微镜检查。结果:各组大鼠缺血前HR和MAP的基础值无显著性差异（P＞0.05）,再灌注1 h后的血红蛋白和血氧饱和度无显著性差异（P＞0.05）。各组大鼠在缺血-再灌注期间各时间点的HR和MAP亦无显著性差异（P＞0.05）。除Ⅰ组之外,其余各组在再灌注2 h和24 h的NDS评分的组内比较均无显著性差异（P＞0.05）。与Ⅱ组相比,再灌注2 h时,Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组的NDS评分均显著降低（P＜0.05）;再灌注24 h时,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组的NDS评分均显著降低（P＜0.05）。与Ⅷ组相比,再灌注24 h时,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ组的NDS评分均显著升高（P＜0.05）。与Ⅱ组相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组的脑梗死面积均显著减小（P＜0.05）;与Ⅷ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组的梗死面积均显著升高（P＜0.05）。与Ⅱ组相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组缺血侧MAP2蛋白的表达均显著升高（P＜0.05）,与Ⅷ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组缺血侧MAP2蛋白的表达均显著降低,（P＜0.05）。在再灌注即刻,MCAO缺血组（Ⅰ组）缺血侧脑组织的血浆容量和血管直径较对侧和假手术组显著降低（P＜0.05）,MCAO缺血组非缺血侧脑血管直径也较假手术组显著降低（P＜0.05）;再灌注24h后,与Ⅱ组相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组脑组织血浆容量、血管直径和血管节段长度均显著升高（P＜0.05）,与Ⅷ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ组缺血侧的脑血浆容量均明显降低（P＜0.05）。与Ⅲ组或Ⅳ组相比,Ⅴ组的所有检测指标均无显著性差异。结论:通过本研究,我们得出以下结论:1.在局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠,缺血后处理、缺血远隔后处理和大剂量纳洛酮后处理均具有显著的神经保护作用,表现为脑梗死减少和神经功能障碍改善。2.联合应用缺血后处理和缺血远隔后处理并不显著增强对局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用。3.纳洛酮后处理的神经保护作用只有在大剂量（10 mg/kg）下才能得以体现。4.联合应用缺血后处理、缺血远隔后处理和大剂量纳洛酮后处理这三种措施可进一步增强后处理的神经保护作用。5.后处理可显著增加缺血脑组织的血浆灌注,并且其神经保护效应与MAP2蛋白表达增强高度相关。
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