JNK3与p65相互作用的分子机制及其功能研究

论文摘要

本课题是在用高通量酵母双杂交技术筛选诱饵蛋白c-Jun氨基末端激酶3（c-Jun N-terminal kinases 3,JNK3）在人肝脏cDNA文库相互作用蛋白结果上的深入研究,p65是筛选到的JNK3的猎物之一。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases,JNKs）为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases,MAPK）超家族成员之一。在脊椎动物,JNK由jnk1、jnk2、jnk3三种基因编码,表达的JNK1、JNK2、JNK3蛋白主要位于细胞质,为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在成人大脑中,这三种蛋白激酶的基因转录产物由于剪切方式的不同有10种亚型。JNK3与JNK1和JNK2的不同在于:JNK3有一个与位于JNK1和JNK2的N末端保守的甲硫氨酸残基融合在一起的延长的N末端区域;JNK1和JNK2在组织内广泛表达,JNK3在脑、心脏、睾丸等组织特异表达。近年来研究发现JNK3参与神经细胞凋亡的调控,可促进缺血、缺氧、有毒化学物质导致的神经细胞的凋亡。核因子κB（nuclear factor of kappa B,NF-κB）是一组重要的转录因子。NF-κB复合体是由Rel家族不同成员组成的二聚体。Rel家族包括RelA（p65）,c-Rel,RelB,NF-κB1（p105）和NF-κB2（p100）五个成员,蛋白酶水解NF-κB1和NF-κB2产生p50和p52。最常见的是p50/p65二聚体。在大多数细胞中,这些二聚体与抑制蛋白IκB（主要成分为IκB-α）结合成无活性的三聚体存留于细胞质中,当受到外界刺激时,IKK首先被激活,磷酸化IκB-α使其失活,IκB-α与p50/p65复合体解离,p50/p65进入细胞核,诱导相关基因表达,抑制细胞凋亡。JNK3激酶与p65蛋白在TNF-α活化的细胞凋亡信号通路里通过启动不同的下游靶基因来发挥互相拮抗的作用。TNF-α与其受体结合后,引起细胞内死亡区相聚,此后TNFR相关死亡区蛋白（TRADD）再结合其上。TRADD的作用犹如一个平台,一面结合FADD并激活半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白8（caspase 8）,进而激活其它caspase家族成员,最终导致细胞凋亡;另一面结合受体相互作用蛋白（RIP）,后者再结合TNFR相关因子2（TRAF2）,TRAF2是连接JNK通路和NF-κB通路的枢纽蛋白,既可激活细胞内NF-κB信号通路,抑制细胞凋亡,又可激活JNK信号通路,促进细胞凋亡。但是JNK3激酶与P65蛋白的直接相互作用还未见文献报道,这是我们得到的一个非常有意义的发现。由于酵母双杂交技术本身存在着缺陷,难免出现假阳性,首先要运用多种实验手段对JNK3激酶与P65蛋白相互作用进行验证。我们通过酵母回转实验验证了JNK家族成员JNK1、JNK2和JNK3与p65的相互作用,结果只有JNK3与p65回转结果阳性,确定了开展JNK3与p65相互作用研究的实验基础。随后构建了携带FALG标签的JNK3和携带Myc标签的p65真核表达载体,共转染HEK293细胞,免疫共沉淀实验验证JNK3和p65相互作用。用FALG抗体进行免疫沉淀,对免疫沉淀复合物进行Western Blot,用Myc抗体检测,结果在沉淀复合物中检测到了p65,而在对照中未检测到p65,从而在哺乳动物细胞内验证了JNK3与p65存在相互作用。由于p65在细胞中是组成性表达的,在HEK293细胞中有很强的内源p65表达,用携带FLAG标签的JNK1、JNK2和JNK3融合蛋白与HEK293细胞内源p65进行半内源免疫共沉淀实验,用p65特异抗体进行免疫沉淀,对免疫沉淀复合物进行Western Blot,用FLAG抗体检测,结果在沉淀复合物中只有JNK3和p65有相互作用,进一步确定了JNK3与p65相互作用的特异性。构建携带绿色荧光蛋白的JNK3和红色荧光蛋白的p65真核表达载体,共转染HEK293细胞,激光共聚焦显微镜观察,结果JNK3和p65共定位于细胞浆,确定了JNK3和p65在细胞内相互作用的部位。由于JNK3只有一个激酶结构域,而p65有Rel同源结构域（Rel homology domain,RHD）和转录激活结构域（transactivation domain,TAD）两个主要功能结构域。为了验证JNK3与p65相互作用的结构域,构建了表达GST-JNK3融合蛋白的原核表达载体,转化BL-21,经IPTG诱导,GST-JNK3融合蛋白主要以包涵体形式表达,经过变性和复性,得到了可溶性GST-JNK3融合蛋白;按结构域构建了一系列p65截短体的真核表达载体,转染HEK293细胞,获得了p65截短体的真核细胞表达蛋白,通过GST-pull down实验确定了JNK3与p65 RHD结构域的（201-312）位氨基酸区域发生相互作用。荧光素酶报告基因实验检测JNK3与p65相互作用对NF-κB转录活性的影响。3×κB-luc是含有3个κB位点的荧光素酶报告基因质粒,用表达Myc-JNK3融合蛋白的质粒与其共转染HEK293细胞,JNK3能明显抑制NF-κB报告基因的转录活性;转染pCMV-Myc-p65质粒提高细胞内p65蛋白水平,给细胞加入TNF-α或IL-1β刺激,均可明显激活NF-κB报告基因,JNK3对激活的NF-κB报告基因有明显抑制作用,且随着JNK3转染量的增加,抑制程度增加。用NF-κB转录因子启动的下游靶基因E-selectin、ICAM-1、IFN-β、IL-6的含有NF-κB结合位点的启动子构建的荧光素酶报告基因进一步检测JNK3对NF-κB的靶基因转录活性的影响。在加入TNF-α刺激后,E-selectin-luc、ICAM-1-luc、IFN-β-luc、IL-6-luc均被激活,JNK3可明显抑制E-selectin-luc和ICAM-1-luc报告基因的转录活性,且随着JNK3转染量的增加,抑制程度增加;但是JNK3对IFN-β-luc和IL-6-luc报告基因的转录活性没有明显抑制作用。荧光素酶报告基因实验结果说明JNK3可抑制NF-κB的转录,但是JNK3对NF-κB靶基因转录的抑制是有选择性的,JNK3抑制与肿瘤细胞侵袭转移相关基因E-selectin和ICAM-1的转录,而对炎症因子IFN-β和IL-6的转录没有影响,该选择性是与JNK3的功能相关的,提示JNK3可能是一肿瘤抑制基因。为了验证JNK3对p65转录活性的抑制是否依赖其激酶活性,分别将野生型JNK3和突变失活型JNK3与3×κB-luc荧光素酶报告基因质粒共转染HEK293细胞,加入IL-1β刺激可明显激活NF-κB的转录活性,野生型JNK3和突变失活型JNK3均可抑制NF-κB的转录;由于IL-1β同时也是JNK3的激活剂,与突变失活型JNK3相比,野生型JNK3对NF-κB的转录活性的抑制更为明显,说明JNK3对p65转录活性的抑制部分依赖其激酶活性,JNK3可能对p65进行了磷酸化,从而抑制了其转录活性,但是该结论还需体外激酶实验进一步验证。EMSA实验检测JNK3对NF-κB转录因子DNA结合能力的影响。在细胞内转染pCMV-Myc-p65质粒或在收细胞前6 h加入TNF-α刺激均可增强NF-κB转录因子的DNA结合能力,与pCMV-Myc对照相比JNK3可明显削弱NF-κB转录因子的DNA结合能力,且随着JNK3转染量的增加,NF-κB的DNA结合能力逐渐下降。对分离的细胞浆和细胞核蛋白进行Western Blot,检测JNK3对p65核移位的影响,结果JNK3对p65核移位没有明显影响。提示JNK3与p65相互作用抑制NF-κB转录因子的DNA结合能力是JNK3抑制NF-κB转录因子转录活性的可能机制。为了进一步研究JNK3与p65相互作用的功能,我们成功构建了稳定表达JNK3的HEK293细胞株,JNK3能明显促进表阿霉素诱导的细胞凋亡,该细胞株为进一步研究JNK3与p65相互作用的功能提供了基础。本课题通过对JNK3与p65相互作用的验证和功能研究,得出JNK3与p65 RHD结构域的（201-312）位氨基酸区域发生相互作用,JNK3抑制了p65的DNA结合能力,从而抑制了NF-κB转录因子的转录活性,提出JNK信号通路和NF-κB信号通路crosstalk的新机制,丰富了JNK信号通路和NF-κB信号通路之间的交联。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 JNK3 与p65 相互作用的验证
• 第一节 酵母回转实验验证 JNK3 与p65 存在相互作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 免疫共沉淀实验验证 JNK3 与p65 存在相互作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 JNK3 与p65 在细胞内的共定位
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四节 GST pull-down 实验确定JNK3 与p65 相互作用的结构域
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 JNK3 与p65 相互作用的功能研究
• 第一节 JNK3 对NF-κB 转录活性的抑制作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 JNK3 抑制p65 的DNA 结合能力
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 JNK3 稳定细胞系的建立及其与细胞凋亡关系的研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 博士期间发表的论文