破囊壶菌△4-脱饱和酶基因的表达及其5’端侧翼调控区域的研究

论文摘要

为验证海洋破囊壶菌△4-脱饱和酶cDNA序列的基因功能,构建重组表达质粒,并以酿酒酵母作为宿主进行功能表达分析,添加外源脂肪酸C22:5底物,半乳糖诱导表达后,阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22:6（占酵母总脂肪酸含量的41.13%）,△4-脱饱和酶基因（FAD4）在酿酒酵母中得到了表达。利用重叠延伸PCR技术扩增△5-延长酶基因（ELO5）和FAD4的融合基因ELO5-FAD4,测序验证后构建重组表达质粒,转化酿酒酵母并添加外源脂肪酸C20:5底物,半乳糖诱导表达。与对照菌相比,阳性克隆子总脂肪酸中出现了与二十二碳六烯酸C22:6甲酯标准品相对应的新峰,从而获得更经济的DHA工程菌株。为进一步了解FAD4转录调控的分子机制,通过LA-PCR方法,从破囊壶菌基因组DNA中扩增得到约1000bp的FAD4 5’端侧翼区域的单一产物,并进行序列测定及提交GenBank数据库（GenBank accession No.EU074209）。经启动子软件与序列比对分析,该序列分别有类似于TATA盒、CAAT盒、GC盒等元件,这些元件均是真核启动子序列的基本结构特征。对FAD4 5’端侧翼区域进行片段缺失扩增,得到系列亚克隆片段,连接到以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的pGlow-TOPO质粒中,构建了系列重组表达质粒,并成功转化大肠杆菌E.coli TOP10。荧光显微观察表明阳性转化子均发出绿色荧光,它们启动绿色荧光蛋白表达的功能得到确认。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 多不饱和脂肪酸概况
• 1.2 DHA的主要生理功能
• 1.3 脂肪酸脱饱和酶的研究进展
• 1.3.1 脂肪酸脱饱和酶的种类和分布
• 1.3.2 脂肪酸脱饱和酶的基本结构特征
• 1.3.3 膜结合脂肪酸脱饱和酶的分子生物学研究进展
• 1.4 启动子的克隆和研究方法
• 1.4.1 启动子的一般结构特征
• 1.4.2 基于PCR技术的启动子克隆方法
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 本研究的技术路线
• 1.7 本研究的创新点
• 4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达'>第2章 海洋破囊壶菌FJN-10 Δ⁴-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 4-脂肪酸脱饱和酶基因的扩增'>2.3.1 Δ⁴-脂肪酸脱饱和酶基因的扩增
• 2.3.2 重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.3.3 酿酒酵母工程菌的诱导表达
• 2.4 小结与讨论
• 5-延长酶基因和Δ⁴-脱饱和酶基因在酿酒酵母中的共表达'>第3章 海洋破囊壶菌FJN-10 Δ⁵-延长酶基因和Δ⁴-脱饱和酶基因在酿酒酵母中的共表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 ELO5和FAD4基因的扩增
• 3.3.2 ELO5-FAD4融合基因的扩增
• 3.3.3 重组质粒pMD-ELO5FAD4的构建
• 3.3.4 ELO5-FAD4融合基因共表达载体的构建与鉴定
• 3.3.5 ELO5-FAD4融合基因在酿酒酵母中的诱导表达
• 3.4 小结与讨论
• 4-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域的克隆和序列分析'>第4章 海洋破囊壶菌FJN-10 Δ⁴-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域的克隆和序列分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 海洋破囊壶菌FJN-10基因组DNA的提取与酶切
• 4-脱饱和酶基因5'端侧翼区域LA-PCR扩增'>4.3.2 海洋破囊壶菌Δ⁴-脱饱和酶基因5'端侧翼区域LA-PCR扩增
• 4.3.3 LA-PCR产物的转化与筛选
• 4.3.4 LA-PCR产物测定与序列分析
• 4.4 小结与讨论
• 4-脱饱和酶基因5'端侧翼区域进行功能分析'>第5章 利用报告基因GFP对海洋破囊壶菌FJN-10 Δ⁴-脱饱和酶基因5'端侧翼区域进行功能分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果与分析
• 4-脱饱和酶基因5'端侧翼区的亚克隆'>5.3.1 海洋破囊壶菌△⁴-脱饱和酶基因5'端侧翼区的亚克隆
• 5.3.2 重组表达质粒的构建与鉴定
• 5.3.3 细胞显微观察
• 5.4 小结与讨论
• 结论
• 附录 符号简缩表
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历