禽类病原体抗原在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示

论文摘要

本研究在国内外首次利用来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面成功展示了禽流感病毒核衣壳蛋白NP和血凝素蛋白HA1以及鸡毒霉形体粘附素蛋白pMGA等禽类病原体抗原，从而为用苏云金芽胞杆菌投递病原体抗原来研制热稳定性禽用口服疫苗探明了科学道路。1．检测S-层表面展示系统中的受体菌株及载体质粒对小鼠和雏鸡的安全性为了检测展示系统中的受体菌株苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和载体质粒pHT304的安全性，将质粒pHT304电转化入BMB171中，得到菌株BMB304。以BMB304作为受试菌株，对小鼠和雏鸡进行安全性测试，并考察BMB304在鸡肠道中的存留情况，以探索用苏云金芽胞杆菌无晶体突变株作为外源抗原的载体以研制疫苗的可行性。小鼠腹腔一次性注射含1010BMB304营养细胞液1.0mL，观察14天，未发现有急性毒性反应。小鼠饮用含108、107和106BMB304营养细胞／mL的饮用水28天，各组小鼠精神和饮食正常，病理解剖学检查未发现异常变化，各剂量组小鼠体重变化、脏器系数、血常规指标及血液生化指标与对照组相比无显著性差异。雏鸡24小时内灌服含1010BMB304芽胞液1.0mL，14天内未出现急性毒性反应。饲喂雏鸡含108、107和106BMB304芽胞/g饲料28天，雏鸡精神和饮食正常，病理解剖学检查未见任何异常，各剂量组的日增重与对照组相比差异不显著。饲喂雏鸡含106BMB304芽胞／g饲料3天后，经测定，芽胞能在鸡肠道中萌发并至少存留5天但不超过7天。结果表明，受体菌株BMB171和载体质粒pHT304对小鼠和雏鸡安全无毒，且能在鸡肠道内暂时定殖，能作为外源抗原的载体以研制疫苗之用。2．构建含禽类病原体抗原基因的S-层融合蛋白基因通过PCR扩增分别得到欲展示的病原体抗原基因np、npp、ha1p和pmga1.2p。用抗原基因片段替换S-层蛋白ctc基因表面锚定序列slh下游的3’-端或中部片段，分别获得了2个含np基因的重组质粒pSNP和pCSA-SNP；2个含npp基因的重组质粒pCTC-NPP和pCSNPP；2个含ha1p基因的重组质粒pCTC-HA1P和pCSHA1P；2个含pmga1.2p基因的重组质粒pCTC-PMGA1.2P和pCSPMGA1.2P。其中在构建pCSA-SNP、pCSNPP、pCSHA1P和pCSPMGA1.2P这4个重组质粒时，在S-层融合蛋白基因的上游插入了csaAB操纵元，csaAB操纵元对S-层蛋白锚定到细胞表面起重要作用。3．构建含S-层融合蛋白基因的重组菌株将重组质粒电转化入受体菌株BMB171中，分别获得了5个展示NP蛋白的重组菌株BN（含pSNP）、BCN（含pSNP和pMIL-CSA）、C-S（含pCSA-SNP）、BCCN（含pCTC-NPP和pMIL-CSA）和CN（含pCSNPP）；2个展示HA1蛋白的重组菌株BCCH（含pCTC-HA1P和pMIL-CSA）和CH（含pCSHA1P）；2个展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG（含pCTC-PMGA1.2P和pMIL-CSA）和CG（含pCSPMGA1.2P）。其中质粒pMIL-CSA携带有csaAB操纵元，在转化不含csaAB操纵元的重组质粒时要同时转化该质粒，以便给受体菌株提供csaAB操纵元。4．检测外源抗原蛋白在重组菌株细胞表面的展示情况用玻片凝集试验检测5个展示NP蛋白的重组菌株的表面展示情况，用血凝和血凝抑制试验检测2个展示HA1蛋白和2个展示pMGA蛋白的重组菌株的表面展示情况。结果，所有的重组菌株均表现出了预计的生物学活性，说明所构建的S-层融合蛋白基因在受体菌株中得到表达并展示到了细胞表面且具有活性。5．检测重组菌株对小鼠和雏鸡的免疫原性用9个重组菌株的营养细胞分别通过腹腔注射途径免疫SPF级BALB／c小白鼠，用间接ELISA测定小白鼠血清抗体效价。结果，小鼠产生了针对相应外源抗原的抗体，其抗体水平与作为对照的受体菌株BMB171相比差异极显著，说明所构建的重组菌株具有免疫原性。将展示HA1蛋白的重组菌株BCCH和CH以及展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG和CG培养至芽胞形成期，用重组菌株的芽胞液通过口服途径免疫艾维因商品代肉雏鸡，用血凝抑制试验测定接种BCCH和CH的鸡的血清抗体效价，用血清平板凝集试验测定接种BCCG和CG的鸡的血清抗体效价。结果，实验鸡产生了针对相应外源抗原的抗体，其抗体水平与作为对照的受体菌株BMB171相比差异极显著，说明所构建的重组菌株对鸡具有一定的免疫原性。在所构建的重组菌株中，CN（含融合基因csa-ctc-npp）、CH（含csa-ctc-ha1p）和CG（含csa-ctc-pmga1.2p）表现出了最高免疫原活性，故本研究寻找到了S-层融合蛋白基因的最佳构建方式csa-ctc-*（*代表外源抗原基因），即用外源抗原基因替换ctc基因的中部，并将csaAB操纵元构建于ctc基因的上游与ctc基因存在于同一个重组质粒中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 微生物细胞表面展示及S-层蛋白在活菌疫苗研制应用中的研究概况
• 1 微生物细胞表面展示（MCSD）及其应用
• 2 S-层蛋白及其在疫苗研制中的应用
• 2.1 S-层蛋白的定位
• 2.2 S-层蛋白的锚定
• 2.2.1 革兰氏阳性细菌的S-层蛋白在次生细胞壁多聚物上的锚定
• 2.2.2 革兰氏阴性细菌的S-层蛋白在脂多糖（LPS）上的锚定
• 2.2.3 无硬质细胞壁的古细菌的S-层蛋白的锚定
• 2.2.4 csaAB操纵元（Operon）与S-层蛋白的锚定相关
• 2.3 S-层的功能
• 2.4 S-层蛋白在疫苗研制中的应用
• 3 蜡样芽胞杆菌群（Bacillus cereus group）的S-层蛋白
• 4 苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白
• 5 苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统
• 6 禽流感病毒核衣壳蛋白NP和血凝素蛋白HA及禽流感基因工程疫苗研究概况
• 6.1 禽流感病毒简介
• 6.2 核衣壳蛋白NP
• 6.3 血凝素蛋白HA
• 6.4 禽流感基因工程疫苗研究概况
• 7 鸡毒霉形体粘附素蛋白pMGA
• 8 研究目的和意义
• 第二章 苏云金芽胞杆菌无晶体突变株对小鼠和雏鸡的安全性及其在鸡肠道中的存留时间
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株和质粒
• 1.2 实验动物
• 1.3 苏云金芽胞杆菌BMB304对小鼠的安全性试验
• 1.3.1 急性毒性试验
• 1.3.2 长期毒性试验
• 1.4 苏云金芽胞杆菌BMB304对雏鸡的安全性试验
• 1.4.1 急性毒性试验
• 1.4.2 长期毒性试验
• 1.4.3 BMB304在雏鸡肠道中的存留情况试验
• 1.5 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 苏云金芽胞杆菌BMB304对小鼠的安全性试验结果
• 2.1.1 急性毒性试验结果
• 2.1.2 长期毒性试验结果
• 2.2 苏云金芽胞杆菌BMB304对雏鸡的安全性试验结果
• 2.2.1 急性毒性试验结果
• 2.2.2 长期毒性试验结果
• 2.2.3 受试菌株BMB304在雏鸡肠道中的存留情况
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示禽类病原体抗原
• 1 材料与方法
• 1.1 技术路线
• 1.2 质粒与菌株
• 1.3 PCR扩增外源抗原基因
• 1.4 DNA操作
• 1.5 质粒电脉冲转化苏云金芽胞杆菌
• 1.6 展示NP蛋白的重组菌株BN、BCN、C-S、BCCN和CN的玻片凝集试验
• 1.6.1 凝集素的来源
• 1.6.2 凝集原的制备
• 1.6.3 方法
• 1.7 展示HA1蛋白的重组菌株BCCH、CH和展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG、CG的血凝和血凝抑制试验
• 1.7.1 菌悬液的制备
• 1.7.2 阳性血清的来源
• 1.7.3 血凝（HA，haemagglutination）试验方法
• 1.7.4 血凝抑制（HI，haemagglutination inhibition）试验方法
• 1.8 展示NP、HA1和pMGA蛋白的所有重组菌株免疫小鼠实验
• 1.8.1 实验动物
• 1.8.2 免疫抗原的制备
• 1.8.3 免疫程序
• 1.8.4 ELISA测定
• 1.9 展示HA1蛋白的重组菌株BCCH、CH和展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG、CG免疫鸡实验
• 1.9.1 实验动物
• 1.9.2 免疫抗原的制备
• 1.9.3 免疫程序
• 1.9.4 血清抗体效价测定
• 2 结果与分析
• 2.1 S-层融合基因的构建
• 2.1.1 np和npp融合基因的构建
• 2.1.2 ha1p融合基因的构建
• 2.1.3 pmga1.2p融合基因的构建
• 2.2 重组菌株的构建
• 2.3 S-层融合蛋白活性的检测
• 2.3.1 展示NP蛋白的重组菌株BN、BCN、C-S、BCCN和CN的玻片凝集试验
• 2.3.2 展示HA1蛋白的重组菌株BCCH和CH的血凝和血凝抑制试验
• 2.3.3 展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG和CG的血凝和血凝抑制试验
• 2.4 重组菌株免疫小鼠实验结果
• 2.4.1 展示NP蛋白的重组菌株BN、BCN、C-S、BCCN和CN免疫小鼠实验结果
• 2.4.2 展示HA1蛋白的重组菌株BCCH和CH免疫小鼠实验结果
• 2.4.3 展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG和CG免疫小鼠实验结果
• 2.5 重组菌株对商品代肉雏鸡的免疫效果及其安全性考察
• 2.5.1 展示HA1蛋白的重组菌株BCCH和CH对商品代肉雏鸡的免疫效果
• 2.5.2 展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG和CG对商品代肉雏鸡的免疫效果
• 2.5.3 展示HA1蛋白的重组菌株BCCH、CH和展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG、CG对商品代肉雏鸡的安全性考察
• 3 讨论
• 3.1 csaAB操纵元与ctc基因
• 3.2 重组菌株菌落形态的变异
• 3.3 两种融合基因的构建方式
• 3.4 非全长外源抗原基因的表达效果
• 3.5 不含csaAB操纵元的重组菌株BN的展示效果
• 3.6 重组菌株对鸡的免疫效力问题
• 3.7 重组菌株中存在抗性基因的问题
• 3.8 本研究与炭疽芽胞杆菌S-层蛋白表面展示外源抗原的研究比较
• 4 结论
• 总结
• 参考文献
• 读博期间已发表文章和待发表文章
• 致谢