中国人群HIV-1特异性CD8+T细胞应答免疫优势表位的筛选鉴定

论文摘要

目前获得性免疫缺陷综合征（AIDS）已成为严重危害全人类健康的传染病之一。高效抗逆转录病毒疗法能够抑制HIV-1复制,使CD4细胞数量增加,在抗HIV-1感染中取得了一定效果。然而由于这些抗病毒药物价格昂贵、毒副作用大、易产生HIV-1耐药株以及患者依从性不好影响了抗病毒治疗的效果。因此最终需要一种有效的疫苗来控制HIV-1的流行和传播。大量研究表明细胞毒性T细胞（CTL）应答在控制HIV-1中发挥重要作用。因而诱导强烈的CTL应答成为HIV-1疫苗需要考虑的重要因素之一。本研究选择中国大陆HIV-1感染者为研究对象,采用酶联免疫斑点吸附试验（ELISpot）检测覆盖HIV-1 B、C亚型全基因序列肽段诱导的CTL应答反应,分析中国HIV-1感染者HIV-1特异性CTL应答特征;并进一步筛选鉴定一批CTL免疫优势表位。为适合中国人群的HIV-1候选疫苗设计和实验研究提供理论依据。主要研究内容和结果如下:1.在对109例HIV-1感染者B亚型特异性CTL应答检测后发现,413条肽段中382条（92.5%）能够被至少一个HIV-1感染者体内T细胞识别产生应答。识别频率居前4位的肽段均出自Nef蛋白。Gag-p24和Nef无论是识别频率还是应答强度均为最高的蛋白亚单位。相反,Vpu是最低的蛋白单位。2.将HIV-1感染者按照CD4细胞计数划分为CD4<200/μl组,200/μl <CD4<400/μl组及CD4>400/μl组。将三组的CTL应答进行比较发现, CD4<200/μl的HIV-1感染者特异性CTL应答不论是应答强度还是广度都显著低于其他两个组。细致分析发现CD4>400/μl组对Gag,Pol和Rev蛋白的应答广度和强度显著高于CD4<200/μ（lp=0.004和0.034;p=0.026和0.005;p=0.024和p=0.025）。针对Gag应答水平的下降主要是由于Gag-p24和p15诱导的CTL应答的下降。而针对Pol应答水平的下降则与其三个亚单位（RT,Pro和IN）都有关。另外,针对gp120,Vpr和Vif三个蛋白亚单位最强的特异性CTL应答出现在200/μl<CD4<400/μl组。Gag-p24,Nef和RT特异性CTL应答占总应答的比例最高。在对HIV-1特异性CTL应答与病毒载量的关系进行分析后未发现总应答强度与病毒载量间存在显著的相关性。细致分析各蛋白亚单位应答强度与病毒载量关系后,也仅发现CD4<200/μl组的感染者Gag-p15及200/μl<CD4<400/μl组RT特异性CTL应答与病毒载量存在微弱的负相关关系（p=0.031和0.035）。3.比较了HIV-1B、C两个亚型全基因序列肽库诱导的CTL应答后发现,HIV-1B亚型感染者对两个亚型肽段的应答强度和识别肽段数量均无显著差异。将肽段按照被识别能力分为单独识别组和交叉识别组,分别进行Shannon熵值计算,结果显示不同亚型间能够被交叉识别的肽段优先出现在具有亚型熵值更低和组间同源性更高的病毒序列区域（p=0.039和0.018）。4.确定25个重叠肽段为免疫优势区,进一步切割成长度为12个氨基酸的短肽,ELISpot筛选出10个含候选表位的序列。用细胞内细胞因子染色技术（ICS）通过效应细胞（PBMC）与靶细胞（B-LCL）携带HLA-I类分子间匹配关系确定诱导CTL应答效应的表位HLA-I类等位基因限制性。结果显示NEF-C-10肽段RPQVPLRPMTFK（RK12）由HLA-Cw04等位基因限制;VPR-B-2肽段GPQREPYNEWTL（GL12）和GAG-B-13肽段HQRIEIKDTKEAL（HL13）由HLA-B40所限制;NEF-C-27肽段HMARELHPEFY（HY11）,NEF-C-17肽段QGYFPDWQNYTP（QP12）和POL-C-85肽段QKTELQAIYLAL（QL12）由HLA-Cw07所限制;NEF-C-15肽段KKRQEILDLWVY （ KY12 ）和GAG-C-46肽段RALGPGASLEEM（RM12）由HLA-A02所限制;ENV-C-76肽段QQHLLQLTVWGI（QI12）由HLA-Cw06所限制;NEF-C-27肽段RELHPEFYKDC（RC11）由HLA-A11所限制。5.对12个氨基酸肽段进行计算机表位预测。根据预测结果合成候选表位,以及4条在候选表位两端各或加或减一个氨基酸的肽段。通过浓度稀释法再次用ELISpot实验测定表位亲和力,确定最佳表位。本研究共确定10个最佳表位,分别为RPQVPLRPM（RM9）,REPYNEWTL（RL9）,ARELHPEF（AF8）,ARELHPEFYK（AK10）,QGYFPDWQNY（QY10）,RQEILDLWVY（RY10）,IEIKDTKEAL（IL10）,RALGPGASL（RL9）,QKTELQAIY（QY9）和QQHLLQLTV（QV9）。6.对10个新鉴定表位应答频率检测后发现,不同表位在表达特定HLA-I类等位基因的HIV-1感染者中应答频率差异显著。应答频率最高的是HLA-Cw04限制的表位RM9（50%）。在对该表位特异性CD8+T细胞细胞因子的分泌（IFN-γ,IL-2和TNF-α）以及脱颗粒标志CD107a的表达进行了检测后发现,表达CD107a的比例最高（平均0.63%）,其次是IFN-γ（0.19%）。表位特异性应答以单功能应答为主（83.24%）,其中以表达CD107a的应答比例最高（39.47%）。并且随着CD4细胞数量减少,虽然各功能指标均出现下降,但不同组间的功能组合模式并没有发生变化。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 艾滋病流行现状
• 1.1 世界范围内艾滋病流行状况
• 1.2 中国艾滋病流行现况
• 2 HIV-1 病原学
• 2.1 HIV-1 形态结构
• 2.2 HIV-1 基因组
• 2.3 HIV-1 编码的蛋白质
• 3 HIV-1 特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答在HIV-1 感染 中的作用
• 3.1 CTL细胞免疫应答
• 3.1.1 MHC-I限制的免疫优势
• 3.1.2 抗原的加工、呈递和CD8+T细胞的活化
• 3.1.3 CTL对靶细胞的杀伤机制
• 3.2 CTL应答在HIV-1 感染中的作用
• 3.2.1 HIV-1 急性感染期CD8+T细胞应答
• 3.2.2 HIV-1 慢性感染期CD8+T细胞应答
• 3.2.3 HIV-1 特异性CD8+T细胞的功能
• 3.2.4 辅助性T细胞功能的缺失
• 3.2.5 HIV-1 逃避细胞免疫应答
• 3.3 CTL应答的定量分析方法
• 51Cr释放实验'>3.3.1⁵¹Cr释放实验
• 3.3.2 酶联免疫斑点吸附试验（ELISpot）
• 3.3.3 细胞内细胞因子染色（ICS）
• 3.3.4 肽-MHC-I类分子四聚体染色法
• 4 HLA-I类等位基因对HIV感染及病情发展的影响
• 5 HIV-1 特异性CTL表位鉴定
• 正文
• 实验一 HIV-1 特异性CTL 应答特征研究及免疫优势区筛选
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液
• 1.4 HIV-1B、C亚型全基因序列肽库
• 1.5 研究对象
• 2 方法
• 2.1 分离外周血单个核细胞（PBMC）
• 2.2 ELISpot技术检测HIV-1 特异性CTL应答
• 2.3 CD4+T/CD8+T淋巴细胞绝对计数的检测
• 2.4 病毒载量的测定
• 2.5 肽段序列变异率测定
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 HIV-1 感染者的临床资料
• 3.2 HIV-1B亚型特异性CTL应答频率和强度的分布
• 3.3 不同感染阶段HIV-1 特异性CTL 应答特征
• 3.4 HIV-1B、C 亚型间交叉应答反应性检测
• 4 讨论
• 实验二 HIV-1 特异性CTL免疫优势表位筛选鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液
• 1.4 HIV-1 肽段
• 1.5 EB病毒转染的B淋巴母细胞系
• 1.6 研究对象
• 2 方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 人基因组DNA的提取
• 2.3 PCR-SSP技术进行HLA -I类等位基因分型
• 2.4 ELISpot技术确定优势表位位置
• 2.5 ICS检测表位HLA-I类等位基因限制性
• 2.6 表位亲和力测定
• 2.7 多参数流式细胞术细胞功能检测
• 3 结果
• 3.1 免疫优势表位位置的确定
• 3.2 HLA-I类等位基因分型
• 3.3 免疫优势肽段HLA-I类等位基因限制性分析
• 3.4 表位预测及亲和力测定
• 3.5 表位特异性CTL应答频率及功能检测
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢