猪EDG4、EDG7和OTUB1基因初步研究

论文摘要

溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）是一种简单的生物活性磷脂,在多种细胞内有不同的生理作用,是由血小板、成纤维细胞、癌细胞和脂肪细胞分泌的一种多功能“磷脂信使”,其通过G蛋白偶联受体亚族——内皮分化基因（endothelialdifferentiation gene,Edg）在多种重大疾病中,特别是在心血管病、肾脏疾病以及肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。EDG4和EDG7是LPA的受体基因,与三种不同的G蛋白,分别是Gi/o,Gq,和G12/13,相互作用传递LPA诱导的细胞信号,在LPA刺激卵巢肿瘤（ovarian tumor）的生长方面也起到关键作用。OTUB1是卵巢肿瘤超级家族的一员,在免疫系统,与泛激素等相互作用,抑制细胞因子的转录。上述三个基因在卵巢肿瘤的发生、发展中的作用机制有待于进一步研究。同时,小型猪与人在解剖、生理及病理方面非常相似。小型猪被认为重要的人类疾病模型实验动物。本实验首先从猪的不同组织中克隆了上述三个基因,对他们在不同组织的表达规律,基因序列中的SNP位点进行了一系列分析,为在猪体上研究该基因奠定基础,同时为其将来运用于标记辅助育种提供依据。另外,本实验对EDG4和EDG7在染色体上的定位情况及OTUB1蛋白的亚细胞定位进行了分析,为进一步研究阐明这些基因功能奠定基础。主要研究结果如下:1)利用生物信息学和比较基因组学的方法克隆得到了猪的EDG4、EDG7和OTUB1基因,对三个基因的mRNA序列以及蛋白预测序列进行了初步分析。2)利用辐射杂种板技术分别将猪的EDG4和EDG7基因分别定位于猪的第2号和6号染色体上。3)利用RT-PCR技术检测了EDG4、EDG7和OTUB1基因在不同组织表达。结果发现OTUB1基因在多种组织表达,主要在免疫器官表达,在肌肉组织表达量低。而EDG4和EDG7在多种组织中表达量较低,另外它们在大多数组织中的表达量相反。4)构建了猪OTUB1基因的绿色荧光蛋白融合表达载体,转染PK15细胞,利用共聚焦显微镜对这蛋白在细胞内的位置进行了定位,结果发现融合蛋白主要都位于细胞核内。5)在中外猪群中利用PCR-RFLP的方法分别对猪EDG4基因的一个SNP位点进行了判型,结果发现中外猪种在这SNP位点的基因频率上表现出较大差异。6)对EDG4基因的SNP位点的基因频率进行了关联分析,结果是杂合型在屠体斜长和失水率上与纯合子有差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1.综述
• 1.1 溶血磷脂酸研究进展
• 1.1.1 溶血磷脂酸的生物合成与释放
• 1.1.2 溶血磷脂酸的生物学效应
• 1.1.3 LPA受体介导的信号转导通路
• 1.1.4 LPA与肿瘤
• 1.2 LPA受体基因的研究进展
• 1.2.1 LPA受体基因的克隆
• 1.2.2 LPA受体基因的表达分布
• 1.2.3 LPA基因的结构
• 1.2.4 LPA受体基因的染色体定位
• 1.3 国内外SPF猪研究进展
• 1.3.1 国内外SPF猪研究状况
• 1.3.2 净化方案
• 1.3.2.1 环境控制
• 1.3.2.2 获取胎儿的方法
• 1.3.2.3 仔猪的哺育
• 1.3.2.4 病原监测
• 1.3.3.SPF猪在畜牧业中的作用
• 2.研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要数据库及信息软件
• 3.1.2 DNA样品
• 3.1.3 组织样品
• 3.1.4 载体和菌株
• 3.1.5 试剂盒及酶
• 3.1.6 主要试剂
• 3.1.7 主要试剂的配制
• 3.1.8 主要分子生物学软件
• 3.1.9 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪EDG4、EDG7和OTUB1基因克隆
• 3.2.1.1 引物设计
• 3.2.1.2 RT-PCR扩增猪EDG4、EDG7和OTUB1基因
• 3.2.1.3 PCR产物的纯化回收
• 3.2.1.4 纯化PCR产物与pGEM-Teasy载体的连接
• 3.2.1.5 感受态细胞的制备
• 3.2.1.6 连接产物的转化
• 3.2.1.7 菌液PCR鉴定
• 3.2.1.8 阳性质粒酶切鉴定
• 3.2.1.9 序列测定
• 3.2.2 猪EDG4和EDG7基因定位
• 3.2.2.1 基因定位的引物设计
• 3.2.2.2 PCR分型方法
• 3.2.2.3 数据分析方法
• 3.2.3 猪EDG4、EDG7和OTUB1基因表达谱分析
• 3.2.3.1 总RNA的提取
• 3.2.3.2 cDNA的合成
• 3.2.3.3 组织表达谱分析
• 3.2.4 PCR—RFLP检测猪EDG4基因多态性（SNP）
• 3.2.4.1 SNP位点分析
• 3.2.4.2 引物设计与PCR扩增
• 3.2.4.3 PCR-RFLP验证并在群体中检测等位基因频率
• 3.2.4.4 猪基因与性状的关联分析
• 3.2.5 猪OTUB1亚细胞定位载体构建
• 3.2.6 细胞转染
• 3.2.6.1 细胞培养
• 3.2.6.2 用脂质体法进行细胞转染
• 3.2.6.3 转染后的细胞染色和融合蛋白的观察
• 4.结果
• 4.1 EDG4、EDG7和OTUB1基因的功能分析
• 4.1.1 功能域分析结果
• 4.1.2 跨膜预测结果
• 4.1.3 活性位点预测结果
• 4.1.3.1 猪EDG4活性位点预测结果
• 4.1.3.2 猪EDG7活性位点预测结果
• 4.1.3.3 猪OTUB1活性位点预测结果
• 4.2 猪EDG4、EDG7和OTUB1基因分子水平研究
• 4.2.1 猪EDG4、EDG7和OTUB1基因克隆
• 4.2.2 猪EDG4和EDG7基因的染色体定位
• 4.2.3 猪EDG4、EDG7和OTUB1基因组织表达谱分析结果
• 4.2.4 猪EDG4基因多态性
• 4.2.5 猪EDG4等位基因群体多样性
• 4.2.6 猪EDG4等位基因群体多样性的关联分析
• 4.2.7 空载体pEGFP-N1亚细胞定位结果
• 4.2.8 猪OTUB1亚细胞定位结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 本研究的创新点与特色
• 值得进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录1 本研究中所用引物
• 附录2 EDG4、EDG7和OTUB1系统进化关系
• 附录3 猪EDG4、EDG7和OTUB1蛋白质序列
• 附录4 研究生期间发表文章
• 致谢