论文摘要
猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)中的一个重要成员,这个属的成员还有在抗原性和结构上与CSFV密切相关的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhed virus,BVDV)和羊边界病病毒(Border disease virus,BDV),并且以牛病毒性腹泻病毒为原型病毒。CSFV基因组编码4个结构蛋白(C、E0、E1、E2)以及至少7个非结构蛋白( Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。E0蛋白是CSFV的重要结构蛋白,具有RNase活性,可引起动物的淋巴和上皮细胞凋亡,导致免疫抑制。E0蛋白含有227个氨基酸,其中191227氨基酸具有猪瘟病毒特异性,能将CSFV与BVDV和BDV区分,是诊断猪瘟抗体的理想抗原。建立用E0蛋白191227氨基酸为抗原的猪瘟抗体检测技术,将更有利于猪瘟的检测。本研究采用PCR技术,扩增CSFV E0蛋白191227氨基酸残基的基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。将含有目的基因的重组质粒转化表达菌BL21,挑选阳性菌,扩大培养,用IPTG诱导使之进行表达,对诱导表达条件进行优化,确立最佳诱导表达条件。将收获的表达菌进行SDS-PAGE电泳分析,证明表达出的目的蛋白分子质量为12KD,与预期的大小一致。经western-blot鉴定和镍柱亲合层析纯化后的活性验证,表明表达的蛋白具有良好的抗原特异性。同时应用重组蛋白作为抗原,用方阵实验确定了纯化蛋白抗原的包被量和血清的最佳稀释倍数,并对ELSIA方法中的各项条件进行了优化,初步建立检测CSFV血清抗体的间接ELISA方法,为进一步开发重组E0蛋白的ELISA诊断试剂盒奠定了基础。
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