猪瘟病毒E0结构蛋白核心抗原位点的表达及抗原性研究

论文摘要

猪瘟病毒是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）中的一个重要成员,这个属的成员还有在抗原性和结构上与CSFV密切相关的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhed virus,BVDV）和羊边界病病毒（Border disease virus,BDV）,并且以牛病毒性腹泻病毒为原型病毒。CSFV基因组编码4个结构蛋白（C、E0、E1、E2）以及至少7个非结构蛋白（ Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。E0蛋白是CSFV的重要结构蛋白,具有RNase活性,可引起动物的淋巴和上皮细胞凋亡,导致免疫抑制。E0蛋白含有227个氨基酸,其中191227氨基酸具有猪瘟病毒特异性,能将CSFV与BVDV和BDV区分,是诊断猪瘟抗体的理想抗原。建立用E0蛋白191227氨基酸为抗原的猪瘟抗体检测技术,将更有利于猪瘟的检测。本研究采用PCR技术,扩增CSFV E0蛋白191227氨基酸残基的基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。将含有目的基因的重组质粒转化表达菌BL21,挑选阳性菌,扩大培养,用IPTG诱导使之进行表达,对诱导表达条件进行优化,确立最佳诱导表达条件。将收获的表达菌进行SDS-PAGE电泳分析,证明表达出的目的蛋白分子质量为12KD,与预期的大小一致。经western-blot鉴定和镍柱亲合层析纯化后的活性验证,表明表达的蛋白具有良好的抗原特异性。同时应用重组蛋白作为抗原,用方阵实验确定了纯化蛋白抗原的包被量和血清的最佳稀释倍数,并对ELSIA方法中的各项条件进行了优化,初步建立检测CSFV血清抗体的间接ELISA方法,为进一步开发重组E0蛋白的ELISA诊断试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词
• 第一篇 文献综述
• 1.1 CSFV 病毒粒子的结构
• 1.2 CSFV 基因组结构与功能
• 1.3 CSFV 的结构蛋白
• 1.3.1 C 蛋白
• 1.3.2 E0 蛋白（gp44/48）
• 1.3.3 E1 蛋白（gp33）
• 1.3.4 E2 蛋白（gp55）
• 1.4 CSFV 非结构蛋白的研究进展
• 1.4.1 Npro
• 1.4.2 p7
• 1.4.3 NS2～3
• 1.5 CSFV 分子生物学诊断方法
• 1.5.1 反转录-聚合酶链式反应（ RT-PCR ）
• 1.5.2 核酸探针技术
• 1.6 CSFV 疫苗的研究
• 1.6.1 CSFV 基因缺失型弱毒疫苗
• 1.6.2 CSFV 亚单位疫苗
• 1.6.3 CSFV 活载体重组疫苗
• 1.6.4 CSFV 全长感染性cDNA 标记疫苗
• 1.6.5 CSFV 核酸疫苗
• 第二篇 研究部分
• 前言
• 1 材料
• 1.1 菌株、质粒和阳性血清
• 1.2 工具酶和主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 目的片段的制备
• 2.2.1 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.2 PCR 扩增产物的凝胶电泳
• 2.3 表达载体的制备
• 2.3.1 增菌培养
• 2.3.2 pET30c（+）质粒提取
• 2.4 目的片段与表达载体的连接
• 2.4.1 PCR 产物和载体质粒酶切
• 2.4.2 酶切产物的纯化回收
• 2.4.3 连接
• 2.5 30C-E0-1725 重组表达载体的构建
• 2.5.1 感受态细胞的制备
• 2.5.2 连接产物的转化
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 重组质粒在BL21（DE3）中的最佳诱导条件的确定
• 2.7.1 IPTG 最佳诱导温度的确定
• 2.7.2 IPTG 最佳诱导浓度的确定
• 2.7.3 最佳诱导时间的确定
• 2.8 重组表达蛋白的鉴定
• 2.8.1 SDS-PAGE 电泳
• 2.9 Western-blot 分析
• 2.9.1 重组蛋白的大量诱导表达
• 2.9.2 包涵体的分离与纯化
• 2.10 包涵体的分离与纯化
• 2.10.1 重组蛋白浓度的测定及抗原性的测定
• 2.10.2 重组蛋白间接ELISA 检测方法的建立
• 3 结果
• 3.1 目的基因的PCR 结果
• 3.2 重组质粒的鉴定结果
• 3.3 重组质粒的序列分析结果
• 3.4 目的蛋白的表达及其抗原性分析
• 3.5 重组蛋白的制备及纯化
• 3.6 复性重组蛋白浓度及抗原活性的测定
• 3.6.1 重组蛋白浓度的测定
• 3.6.2 重组蛋白生物活性的检测结果
• 3.7 重组蛋白间接ELISA 检测方法的建立
• 3.7.1 棋盘滴定法选择抗原和血清的工作浓度
• 3.7.2 间接ELISA 各项试验条件的优化
• 3.7.3 阴阳性临界值的确定
• 3.7.4 间接ELISA 的特异性检验（交叉试验）
• 3.7.5 间接ELISA 的检测方法
• 3.7.6 间接ELISA 的初步应用
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 试剂的配制
• 个人简介
• 导师简介