三个昆虫蛋白基因的分子克隆、表达及功能研究

论文摘要

分子生物学、基因工程技术等生命科学学科的不断进步,使得药用昆虫的研究得以深入到分子水平。本论文开展了三个昆虫蛋白基因的分子克隆、表达和功能研究。1.桑天牛抗菌肽AgCRP（Apriona gemari Cysteine Rich Protein）基因的分子克隆、表达和功能研究首先,通过桑天牛幼虫的表达序列标签（ESTs）筛选到了目标基因,用RT-PCR技术,成功克隆了AgCRP基因。测序结果表明,AgCRP基因序列全长为207bp,可编码69个氨基酸残基的蛋白。经NCBI数据库检索和氨基酸序列比对分析,AgCRP成熟肽与长角天牛（Acalolepta luxuriosa）抗菌肽AlCRP最为接近,两者同源性达62%;与其他昆虫抗菌肽一样,AgCRP也具有能形成CSαβ模块（Cysteine Stabilizedαβmotif）的“C…CXXXC…C…CXC”保守序列。AgCRP属首次报道的基因序列,已在GenBank登录（登录号:AY771360）。通过Northern blot杂交确定了AgCRP特异表达于桑天牛的脂肪体,并可被伤害、细菌或真菌等刺激上调。证明了AgCRP属于昆虫防御素型抗菌肽。将克隆到的AgCRP基因作EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到pBac-1质粒相应的多克隆位点上,获得重组杆状病毒转移载体pBac-CRP。然后在无血清条件下,以Lipofectin介导bAcGOZA杆状病毒DNA与pBac-CRP共转染草地夜蛾（Sodoptera frugiperda）Sf-9昆虫细胞,细胞呈明显感染形态,这是AgCRP基因首次在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达。2.红光熊蜂（Bombus ignitus）蜂毒蛋白酶（BiVP）和脂酶（BiLP）基因的分子克隆、表达及功能研究首先,通过红光熊蜂的ESTs筛选到了目标基因,用RACE-PCR和RT-PCR技术,分别成功克隆BiVP基因和BiLP基因,测序结果表明,两者的核苷酸序列全长分别1083bp和954bp,可分别编码360个氨基酸残基和317个氨基酸残基的蛋白。推测两个蛋白的分子量分别为39.3kD和34.3kD。经NCBI数据库检索和氨基酸序列比对分析,BiVP具有极为保守的由His、Asp和Set构成的催化三联体（catalytic triad）活性中心,属于丝氨酸蛋白酶;BiLP具有脂酶蛋白的特征保守序列“GXSXG”,属于脂酶类蛋白;两者均属首次报道的基因序列,其中BiLP基因已在GenBank登录（登录号:EU443786）。通过Northern blot杂交对BiVP和BiLP基因的特异性表达进行了考察。两者均特异表达于红光熊蜂的脂肪体。将克隆到的BiVP和BiLP基因作XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到pBac-1质粒相应的多克隆位点上,获得重组杆状病毒转移载体pBac1-BiVP和pBac1-BiLP。然后在无血清条件下,以Lipofectin介导与bAcGOZA杆状病毒DNA共转染草地夜蛾Sf-9昆虫细胞,细胞呈明显感染形态,这是BiVP和BiLP基因首次在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达。以快速蛋白液相色谱法纯化了重组BiVP蛋白,纯化程度约51倍,收率达到了57.8%。在酶活性研究中,发现重组BiVP蛋白的酶活性最适pH值为pH3.0,并在pH2.0～5.0的范围内能够保持活性的稳定。在pH3.0时,其最适温度为45℃,并且能在该温度下保持活性稳定至少10min。本研究实现了对BiVP重组蛋白酶活性的首次检测。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• ABBREVIATIONS
• 前言
• 1.药用昆虫研究的重要意义
• 2.我国药用昆虫研究现状
• 3.选择红光熊蜂和桑天牛作为研究对象的立题依据
• 4.本课题研究的设计思想
• 研究室常用实验方法
• 第一部分 桑天牛抗菌肽（AgCRP）的分子克隆、表达及功能研究
• 第一章 昆虫抗菌肽的研究概况
• 1.1 昆虫抗菌肽的种类与结构特点
• 1.2 昆虫抗菌肽的作用机理
• 1.3 昆虫抗菌肽的生物学活性及构效关系研究
• 1.4 鞘翅目昆虫抗菌肽的研究
• 第二章 桑天牛抗菌肽（AgCRP）的基因克隆、表达和功能研究
• 2.1 实验材料和实验方法
• 2.2 实验结果与分析
• 2.3 讨论
• 第二部分 红光熊蜂（Bombus ignitus）蜂毒蛋白酶（BiVP）和脂酶（BiLP）基因的分子克隆、表达及功能研究
• 第三章 蜂毒的研究与开发利用进展
• 3.1 蜂毒的来源
• 3.2 蜂毒的理化特性和成分
• 3.3 蜂毒的应用
• 3.4 蜂毒的分子生物学研究
• 3.5 小结
• 第四章 红光熊蜂蜂毒蛋白酶BiVP的基因克隆、表达及功能研究
• 4.1 实验材料和实验方法
• 4.2 实验结果与分析
• 4.3 讨论
• 第五章 红光熊蜂脂酶BiLP的基因克隆、表达及功能研究
• 5.1 实验材料和实验方法
• 5.2 实验结果与分析
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章