论文摘要
因创伤感染肿瘤等原因引起的骨缺损目前仍无较好的治疗方法。传统方法主要以自体骨片移植为主,这种治疗方式常易导致供体部位的损伤及功能缺陷。随着组织工程学的发展,体外构建的人工骨有望在不带来严重并发症的前提下彻底重建缺损的骨组织。人工构建的骨组织通常由种子细胞和支架材料构成。羟基磷灰石(HAP)是构成人体硬组织,如牙齿、骨骼的无机成分。人工合成的羟基磷灰石由于与天然硬组织的化学成分相似,因而具有良好的生物相容性,已被许多研究用做构建组织工程骨的支架材料。然而以前人工合成的HAP(cHAP)在颗粒大小与形态方面与天然羟基磷灰石迥然不同。天然骨组织中的羟基磷灰石以数十纳米的晶体形式存在,而正是这些数十纳米晶体的有序排列构成了骨组织的力学属性。以纳米相羟基磷灰石(nHAP)为支架材料的组织工程骨有望获得更好的超微结构上的生物模拟性和更优异的骨传导性。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类从骨髓中分离的具有强大增殖能力和多向分化能力的干细胞,在一定条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肝、神经、心肌等多种组织细胞。较胚胎干细胞具有无致瘤性、无伦理学争议、免疫原性弱等优点。较成骨细胞具有可获得性良好及扩增能力强等优点,因而被广泛认为是骨组织工程种子细胞的理想来源。以骨髓间充质干细胞和纳米相羟基磷灰石复合构建的人工骨有望成为未来骨组织工程研究和应用的主流。组织工程学的重要研究内容之一是支架材料对种子细胞生物学行为的影响。目前nHAP对MSCs生长及分化的影响尚未得到充分阐明。本研究旨在详细阐述作为支架材料的nHAP对于种子细胞MSCs生长及成骨分化等生物学行为的影响。实验结果显示,nHAP颗粒对MSCs的生长、分化、矿化等生物学行为具有广泛的影响。nHAP颗粒对MSCs的生长的作用依剂量不同而有很大区别。nHAP剂量低于20μg/10~4 cells可显著促进细胞生长,然而在无血清培养条件下这种促增殖作用消失。说明这种促进作用与nHAP的蛋白吸附功能有关。吸附血清蛋白的nHAP粘附于细胞表面,使细胞周围产生局部性血清蛋白浓度升高,从而有利于细胞生长。此外当采用插入式培养皿对细胞及颗粒进行分离式共培养时,这种促增殖作用也消失。说明颗粒与细胞的接触对这种促增殖作用是必需的。也从另一个侧面证实nHAP的蛋白吸附功能与其促细胞增殖作用有密切关系。当nHAP剂量高于20μg/10~4cells可显著抑制细胞增殖。在无血清及分离式共培养条件下,这种抑制增殖作用同样存在。说明这种抑制作用是通过颗粒改变培养液条件而产生的。对于细胞分化,nHAP颗粒可显著促进MSCs的成骨分化但却显著抑制细胞矿化,分离式共培养条件下产生同样结果。说明这些作用同样是通过颗粒改变培养液条件而产生的。nHAP对培养液条件的改变最有可能是改变其中的钙磷浓度。经实验发现nHAP可使培养液中的钙磷浓度降低而不是升高。推测可能是nHAP颗粒在培养液中出现晶体生长而吸收钙磷离子,从而降低Ca、P浓度。将MSCs种植于nHAP基质表面,细胞同样可贴壁、增殖与成骨分化。但其贴壁增殖与分化的特征与在普通培养基质(孔板)上显著不同。细胞贴壁的速度与在孔板上相似,均于2h己出现贴壁,约16小时完成贴壁。但贴壁数量显著少于孔板。约60%接种细胞可最终完成贴壁,而在普通孔板上约85%细胞可以完成贴壁。在增殖速度方面,nHAP上的细胞也比在孔板上的细胞慢,它们的倍增时间分别是110hVs60h。然而值得注意的是,尽管增殖速度较慢,nHAP上的细胞同样可以长满底面。因而MSCs在nHAP表面的增殖是可以满足需要的。此外在nHAP上MSCs的成骨分化显著增强。nHAP条件培养液同样可使MSCs成骨分化增强,说明是nHAP改变培养液条件从而促进MSCs成骨分化。此结果与前面实验结果一致。nHAP基质与普通羟基磷灰石基质(cHAP)在表面微地形、亲水性、蛋白吸附、离子交换等特征方面有许多不同。与cHAP相比,nHAP基质更有利于细胞贴壁和增殖。但细胞在两种基质上的成骨分化却大致相当。但由于贴壁和增殖效率高,在接种等量细胞后,nHAP基质上的细胞表达总蛋白、碱性磷酸酶、骨钙素等的总量仍高于cHAP表面的细胞。nHAP可改变培养液中的钙磷浓度。这种改变可能会导致细胞生长分化等生物学行为的改变。为此我们观察了不同钙磷浓度及其组合对MSCs增殖与成骨分化的影响。结果显示,钙磷浓度降低可抑制细胞增殖与分化,而不是促进细胞增殖与分化。当钙浓度升高时,对细胞增殖没有影响,但可促进细胞矿化抑制细胞分化。当磷浓度升高时,可抑制细胞生长但对成骨分化没有显著影响。这部分实验表明,nHAP降低培养液中钙磷浓度,可能是其抑制细胞生长与矿化的机理,但不是其促进分化的机理,nHAP可促进成骨分化的原因有待于进一步研究。作为骨组织工程的重要支架材料,nHAP较非纳米HAP更有利于MSCs生长,因而更适合作为组织工程支架材料。尽管与普通细胞培养表面相比细胞生长缓慢,但最终仍可长满基质表面,因而并不构成严重影响。目前研究中的支架材料尚无可促进MSCs成骨分化的报道。而nHAP可显著促进MSCs成骨分化。因而我们认为nHAP是一种理想的组织工程支架材料。
论文目录
相关论文文献
标签：骨髓间充质干细胞论文; 纳米相羟基磷灰石论文; 成骨分化论文; 贴壁论文; 增殖论文; 组织工程论文;