拟南芥DOS1/CE01及CE02在胁迫反应中的功能研究

论文摘要

在芽殖酵母中,超表达拟南芥基因 CEO1（clone eight-one）的 cDNA 能增强 H2O2转录因子 Yap1 缺失型和野生型酵母的抗氧化能力,另外,CEO1 基因调节拟南芥对 ABA、乙烯、MeJA 的反应。 通过鉴定获得拟南芥 AT1g32230（DOS1/CEO1）和 AT2g35510（CEO2）两个基因的 T-DNA插入缺失纯合突变体 dos1-1 和 ceo2-1。表型分析发现 dos1-1 植株在形态上与 WT 有明显区别:株型小,莲座多,叶片扭曲,花期提前,叶绿素含量高等。而 ceo2-1 在正常条件下没有明显的生态学特征。在 H2O2和 HgCl2处理条件下,dos1-1 的种子萌发和幼苗生长受到严重的抑制,同时,在这种胁迫下 dos1-1 的叶绿素含量急剧下降,有趣的是 HgCl2强烈诱导 dos1-1 中 H2O2的快速产生,即 DOS1 基因可能参与 HgCl2诱导 H2O2产生的信号转导过程。再者,dos1-1 幼苗对甘露醇（渗透胁迫模拟干旱）造成的渗透胁迫也很敏感,离体叶片的定量失水实验同样证明其失水较快。半定量 RT-PCR 分析表明,DOS1 基因在氧化、干旱、HgCl2造成的不同胁迫下表达量都明显地升高,即 DOS1 基因参与氧化和干旱胁迫反应的信号传导过程。 分析 WT 和 dos1-1 中与 H2O2、干旱、HgCl2胁迫反应有关的几个基因表达量,发现在 H2O2、干旱和 HgCl2处理下,WT 和 dos1-1 中的 CAT1 表达量并没有明显区别;而 dos1-1 在 H2O2的处理下,CAT3 表达量明显变低,而在 HgCl2和干旱的处理下 WT 和 dos1-1 中的表达量变化不明显;CAT2 的转录水平在 H2O2、干旱和 HgCl2处理下,dos1-1 中的表达量明显比 WT 中的表达量低;APX1 的表达量在 WT 和 dos1-1 中在 H2O2、干旱和 Hg 处理前后也没有明显的区别。RD28 蛋白是一个主要的内在蛋白（MIP）类似物,一个水通道蛋白。DOS1 基因功能的缺失不影响 RD28 基因的表达,但是在干旱和 HgCl2的处理下,dos1-1 中 RD28 基因的表达量明显比 WT 中的低,而在 H2O2处理下则没有区别,这暗示 RD28 基因的表达对干旱和 HgCl2胁迫比较敏感,即水通道蛋白在干旱和重金属损伤中有重要作用。这些数据更说明了 DOS1 基因在氧化和干旱胁迫中有重要作用。 这些结果暗示拟南芥的 DOS1 蛋白作为分子开关介导 H2O2和干旱的信号转导过程,同时赋予重金属的抗性。

论文目录

• 缩写词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 活性氧产生及信号转导
• 1.1.1 活性氧产生
• 1.1.2 活性氧的信号转导
• 1.2 H202作为信号分子所参与的生理过程
• 1.2.1 气孔运动
• 1.2.2 细胞程序性死亡
• 1.2.3 根的生长
• 1.3 H202与基因表达
• 1.3.1 细菌中H202转录因子OxyR的研究
• 1.3.2 酵母中H202 转录因子Yap1 的研究
• 1.4 拟南芥CE01 的功能研究
• 1.5 立题依据
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 拟南芥的培养方法
• 2.4 拟南芥基因组DNA 和总RNA 的提取
• 2.5 DAB 染色原位检测H202
• 2.6 高效酵母转化
• 2.7 β-galactosidase 的定量测定
• 2.8 T-DNA 插入缺失纯合突变体的鉴定
• 2.9 RNA 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
• 2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.11 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.12 构建载体所用引物序列及基因扩增条件
• 2.13 农杆菌介导的拟南芥的转化（Floral dip）
• 2.14 拟南芥潜在转化株的筛选方法
• 2.15 GUS染色
• 2.16 反转录制备拟南芥cDNA
• 2.17 叶绿素的测定方法
• 2.18 实验常用溶液
• 3 实验结果
• 3.1 T-DNA 插入缺失纯合突变体的鉴定结果
• 3.2 D051 功能分析
• 3.2.1 纯合突变体d051-1 的表型鉴定
• 3.2.2 d051-1 对干旱和渗透胁迫敏感
• 3.2.3 d051-1 提高对H202 和HgC12 胁迫的敏感性
• 3.2.4 HgC12处理下d051-1 体内H202的变化
• 3.2.5 D051 基因调控与H202 清除和水通道有关基因的表达
• 3.2.6 D051 基因重组载体的鉴定及拟南芥潜在转化株的筛选结果
• 3.2.6.1 重组载体的鉴定
• 3.2.6.2 重组质粒转化农杆菌的鉴定
• 3.2.6.3 拟南芥潜在转化株的筛选结果
• 3.2.7 HAD1 蛋白与D051 蛋白相互作用
• 3.2.8 转化株表型初步鉴定
• 3.3 CE02 功能的初步分析
• 3.3.1 ce02-1 表型鉴定
• 3.3.2 ce02-1 可能对干旱不敏感
• 3.3.3 ce02-1 对HgC12 胁迫不敏感
• 3.3.4 CE02 基因重组载体的鉴定及拟南芥潜在转化株的筛选结果
• 3.3.4.1 重组载体的鉴定
• 3.3.4.2 重组质粒转化农杆菌的鉴定
• 3.3.4.3 拟南芥潜在转化株的筛选结果
• 3.3.5 HAD1 蛋白与CE02 蛋白相互作用
• 3.3.6 CE02 基因在拟南芥组织中的定位
• 4 讨论
• 4.1 D051 基因的T-DNA 插入缺失纯合突变体为隐性单基因突变
• 4.2 D051 基因介导氧化和干旱胁迫的信号转导过程
• 4.3 D051 蛋白调节氧化胁迫有关基因的表达
• 4.4 D051 蛋白在多种胁迫反应中可能是一个开关分子
• 4.5 CE02 基因可能参与干旱和HgC12 形成的氧化胁迫的反应过程
• 4.6 CE02 基因在拟南芥的幼叶、根的下部表达量较高
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢