论文摘要
结核病是严重威胁人类健康的最重要传染病之一。据WHO估计,2007年全世界每年新感染结核病患者927万人,其中有410万人是痰菌阳性结核病患者。单2007年死亡的结核病患者人数高达177.6万,其中合并HIV感染的结核病患者死亡人数是45.6万。结核分枝杆菌感染人数众多,但只有5%-10%的感染者发病。这说明结核病患者自身免疫功能异常是结核病发生、发展的重要原因。近年来由于耐多药结核（MDR-TB）和严重耐药结核（XDR-TB）病例的增加,现有的抗结核药物难以满足治疗需求,导致了一定比例的难治肺结核。在此背景下,结核病免疫防治的重要性进一步凸显出来。通过研究分析结核病患者免疫功能的异常的机制,为结核病免疫防治寻找新的治疗及药物作用靶点,研制新型结核病疫苗和建立有效的疫苗免疫评估方法是目前结核病防治工作的重要突破口。抗结核保护性免疫主要依赖CD4+和CD8+T细胞。CD4+T数量减少及功能异常是艾滋病发病的主要机制,而艾滋患者对结核病高度易感,证明了CD4+T细胞免疫在抗结核免疫中的关键作用。CD4基因缺陷小鼠虽然在结核分枝杆菌感染早期抵抗力显著降低,但中后期抗结核免疫力与正常小鼠相似,提示CD8+T细胞在结核免疫保护中也发挥了非常重要的作用。为了研究结核抗原特异性T细胞免疫应答反应,我们使用CD154（CD40L）作为抗原特异性CD4+T细胞的激活标志,建立了通过结核抗原特异性刺激后CD4及CD154的表达确定结核抗原特异性CD4+T细胞的研究方法,该方法不同于以往常用的四聚体（tetramers）技术和细胞因子检测的方法,不需要知道被检测个体的MHC类型以及事先筛选适合的抗原多肽;完全不依赖于T细胞的细胞因子检测。CD27是肿瘤坏死因子受体家族成员之一,在效应T淋巴细胞和记忆T细胞的分化和功能中发挥了重要作用。我们对肺结核病患者抗原特异性CD4+T细胞CD27的表达情况进行了研究。研究结果表明,与PPD试验阳性的健康对照者相比,结核病患者的CD27+抗原特异性CD4+T细胞的比例显著降低（P=0.032）。与菌阳初治结核病患者（P=0.008）及健康对照者（P=0.005）相比,久治不愈的肺结核病患者CD27+抗原特异性CD4+T细胞的比例显著降低;但菌阳初治结核病患者与健康对照者相比,CD27+抗原特异性CD4+T细胞的比例没有统计学差异。CD27+抗原特异性CD4+T细胞与CD27-抗原特异性CD4+T细胞相比,能表达更高的Ki-67,说明其具有更强的增殖能力。CD27+抗原特异性CD4+T细胞与CD27-抗原特异性CD4+T细胞相比,能产生IFN-γ的比例更高。经过进一步统计分析表明,CD27的表达与年龄没有明显相关性;对CD27+抗原特异性CD4+T细胞的比例与肺结核病患者临床资料进行二元逻辑回归分析表明:CD27+抗原特异性CD4+ T细胞的比例降低与久治不愈的肺结核呈显著相关（P=0.002, odds ratio=19.6）。与分析的其余临床资料（患者的性别、年龄、痰菌培养结果,是否有肺空洞,结核性胸膜炎,支气管结核）均无显著相关性。总之,久治不愈的肺结核患者的CD27+抗原特异性CD4+T细胞与初治肺结核病患者及健康对照相比明显减少。逻辑回归分析显示:CD27+抗原特异性CD4+T细胞百分比与久治不愈的肺结核密切相关。该研究提示可将CD27+抗原特异性CD4+ T细胞作为结核病防护及临床治疗效果的监控靶点,对耐药结核病诊断及治疗起到预警作用,还可用于结核病患者免疫功能的评估的免疫学分子标识,通过评估及时采用免疫调节治疗,达到提高治疗效果的目的。记忆T细胞（memory T cells）来源于初始T细胞（na?ve Tcells）。初始T细胞在抗原刺激下,迅速扩增,分化为效应T细胞,发挥细胞免疫的功能;部分细胞分化为记忆细胞。记忆T细胞对特异性抗原有记忆能力,寿命长,可在体内长时间存活并自我更新,当再次遇到相同抗原后,可产生更快、更强和更有效的二次免疫反应。这是因为记忆T细胞与初始T细胞相比,需要抗原的浓度低,更容易被抗原激活,对共刺激分子的依赖性较低。记忆T细胞是机体预防细胞内病原菌再次感染的基础,诱导记忆T细胞产生是高效疫苗必备的条件。根据CD45RA和CCR7表面标记,可将CD8+记忆T细胞可分为CD45RA-CCR7+ TCM（central memory T cell,中央记忆T细胞）,CD45RA-CCR7-TEM（effector memory T cell,效应记忆T细胞）和CD45RA+CCR7-TEMRA（RA+ effector memory T cell,RA阳性效应记忆T细胞）,其中TCM和TEMRA均为效应记忆T细胞。以往研究显示,抗原特异性TEMRA表达高水平的颗粒酶,可以直接溶解结核分枝杆菌寄生的巨噬细胞,抑制结核分枝杆菌在体内的增殖。抗TNF免疫治疗导致的结核病发病率显著增加可能与TEMRA数量下降密切相关。这些研究提示,TEMRA在抗结核免疫中发挥了非常重要的作用。到目前为止,对结核分枝杆菌抗原特异性记忆T细胞亚群在抗结核免疫中作用的了解还非常有限。本研究对24例活动性肺结核病患者及22例潜伏感染者的CD8+记忆T细胞的产生及分布特性进行了初步研究,建立了基于CD107a为分子标识的结核抗原特异性CD8+T细胞检测方法。通过对24例活动性肺结核病患者及22例潜伏感染者的对比分析发现,与潜伏感染人群相比,活动性肺结核病患者CD45RA阳性CD8+效应记忆T细胞（CD8+TEMRA）亚群比例显著增加（活动性肺结核病患者59.94±3.87%,潜伏感染者46.65±2.88%,P=0.0203）,活动性肺结核病患者CD8+效应记忆T细胞（CD8+TEM）亚群分布频率显著降低（活动性肺结核病患者38.14±3.87%,潜伏感染者52.34±2.95%,P=0.0142）。我们推测:活动性肺结核病患者与潜伏感染者抗原特异性CD8+效应记忆T淋巴细胞亚群的比例存在明显差异可能与体内抗原刺激的程度及特异细胞免疫应答反应相关。该结果为进一步研制新型高效的结核病疫苗和建立有效的疫苗免疫评估方法奠定了基础。髓系抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）是一群未成熟髓系细胞（ immature myeloid cells, IMCs）,该群细胞在正常情况下可分化为树突状细胞（dendritic cells,DCs）、巨噬细胞和（或）粒细胞。研究显示MDSCs具有抑制天然及获得性细胞的功能。现已证明,在一些肿瘤、感染及自身免疫疾病等病理情况下,MDSCs的数量和比例显著增加。但到目前为止,结核病患者外周血中的MDSCs的状况还不清楚。本研究采用流式细胞术对活动性肺结核病患者、潜伏感染者的髓系抑制性细胞（MDSCs）的产生及分布特性进行了初步研究。通过对78例活动性肺结核病患者、30例潜伏感染者及66例健康人的对比分析发现,活动性结核病患者CD14-HLA-DR-CD33+CD11bhighMDSCs细胞比例显著高于潜伏感染者（P=0.023）,也高于健康人（P=0.001）;活动性结核病患者CD14+HLA-DR-髓系抑制性细胞的比例与潜伏感染者和健康人在统计学上没有显著差异。提示活动性肺结核病可能诱导特有MDSC亚群的增高,发挥免疫抑制作用,促进结核病的发生及发展。