重组表达稻瘟菌激发子对水稻油菜生长和抗性的影响

论文摘要

激发子作为一类对病原菌无直接毒杀作用却可诱导植物产生多重防御反应的化合物，在植物病虫害生物防治中具有重要应用前景。为了进一步挖掘天然条件下存在的激发子资源，研究从稻瘟菌（Magnaporthe griesea）中分离纯化出提高水稻和油菜抗病和促进生长性能的蛋白激发子，就其诱导抗性的作用机理及差异表达蛋白进行了系列研究，结果如下：（1）从稻瘟菌的粗提物中纯化了稻瘟菌激发子，用从稻瘟菌中分离到的激发子注射兔子，得到了激发子的抗体。同时用LC-ESI-MS／MS对其进氨基酸测序。用稻瘟菌总cDNA作模板通过PCR得到这个基因。这个基因被命名为pemg1（Protein Elicitor from Magnaporthe griesea）．本研究把pemg1基因连入pET28a载体的EcoRⅠ和XhoⅠ位点进行原核表达。重组的稻瘟菌激发子蛋白（His6-PEMG1p）的表达量约占总蛋白量的7％，通过Mag His Extraction kit用磁珠法纯化His6-PEMG1p，结果在12％SDS-PAGE上得到了均一的42kD的单带。我们通过western-Blotting证明，42kD的His6-PEMG1p与天然提取的稻瘟菌激发子具有相同的抗原性，这证明了表达和纯化的成功。（2）用纯化的10ug．m-1的His6-PEMG1p处理水稻，研究了四个与防御相关的基因对His6-PEMG1p处理的应答。RT-PCR的结果表明：用His6-PEMG1p处理，可以提高stkm，fad，pbz1，pr1基因的表达。同时研究还发现His6-PEMG1p处理以后，能显著提高水稻POD和PAL等防御相关酶的活性，在处理以后后第4h时。本研究还证明，叶面喷施His6-PEMG1p后，水稻对稻瘟菌的抗性有明显提高，分别在第14d和第21d的防治效果分别为46.7％和37.23％。用双向电泳分析表明用His6-PEMG1p处理以后在水稻叶片上找到了14个蛋白（斑点）表达上调。这说明His6-PEMG1p能够引起水稻叶片蛋白的表达变化。（3）本研究用His6-PEMG1p对油菜种子浸种，发现了在能够促进油菜的种子的萌发，能够提高发芽率10.5％。发芽的种子长势整齐，根系活力比对照平均高出38.7％，茎长比对照高出48.1％。本研究还证明了了His6-PEMG1p能诱导油菜对菌核病的抗性。在离体叶片上接种油菜菌核病，接种后第2d，第3d，第4d的病斑直径分别为0.92cm，1.52cm，1.90cm，比同期对照的病斑直径都小，达到显著的水平。（4）通过双向电泳，鉴定到了His6-PEMG1p能够诱导油菜叶片中至少五个蛋白的上调表达，通过比较这五个蛋白的肽指纹图谱，这五个上调表达的蛋白分别：Peroxidase，Rubisco，Myrosinase，Malate dehydrogenase，和一个未知蛋白。因此，His6-PEMG1p对油菜的影响可能是诱导了油菜生长和防御相关酶的活性，从而加速了油菜的三羧酸循环，提高油菜光合用速率和油菜对有害生物的防御能力。稻瘟菌激发子作为一种生物活性的蛋白质，具有促进植物生长和诱导植物抗性的作用。本研究报道了纯化稻瘟菌激发子的技术路线和从稻瘟菌克隆出稻瘟菌激发子的基因。为研究植物和病原物的交互作物和开发激发子的潜力提供依据和基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物与病原物的相互作用
• 1.2 激发子的分类
• 1.2.1 寡糖激发子
• 1.2.2 脂类激发子
• 1.2.3 蛋白激发子
• 1.2.4 其他激发子
• 1.3 蛋白激发子的种类及研究进展
• 1.3.1 过敏蛋白Harpin
• 1.3.2 隐地蛋白
• 1.3.3 植物激活蛋白
• 1.4 植物的诱导抗性
• 1.4.1 系统获得性中诱导发生的早期事件
• 1.4.2 GTP结合蛋白的激活
• 2+信号'>1.4.3 离子流和Ca²⁺信号
• 1.4.4 活性氧（Reactive oxygen species,ROS）猝发
• 1.4.5 激发子处理植物以后信号转导过程
• 1.5 表达差异蛋白的筛选方法
• 1.5.1 双向电泳的方法
• 1.5.2 高效液相与其联用技术
• 1.5.3 同位素代码与其标记技术
• 1.5.4 蛋白芯片
• 1.6 立题依据和实验设计
• 1.6.1 实验背景
• 1.6.2 实验设计
• 第二章 稻瘟菌激发子蛋白的纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种及植物材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 培养基及缓冲液的配制
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 稻瘟菌激活蛋白的提纯
• 2.2.1 粗蛋白的提纯
• 2.2.2 激发子蛋白的进一步纯化
• 2.2.3 激发子蛋白氨基酸序列的测定
• 2.2.4 激发子蛋白的糖基化检测
• 2.2.5 烟草愈伤组织和悬浮细胞的获得
• 2.2.6 稻瘟菌激发子的抗体制备
• 2.2.7 稻瘟菌激发子抗体的纯化
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 烟草悬浮细胞的获得
• 2.3.2 稻瘟菌植物激活蛋白的分离和纯化
• 2.3.3 对稻瘟菌激发子的质谱测序和糖蛋白检测
• 2.3.4 稻瘟菌激发子抗体纯化的结果
• 2.4 小节讨论
• 第三章 稻瘟菌激发子基因克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与载体
• 3.1.2 主要试剂及缓冲液
• 3.1.3 主要仪器及耗材
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 总RNA提取
• 3.2.2 第一链cDNA合成
• 3.2.3 RT-PCR
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 RNA提取结果
• 3.3.2 稻瘟菌激发子pemg1的获得
• 3.4 小节与讨论
• 第四章 pemg1基因的原核表达和重组激发子对水稻生物活性的测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 载体,菌株与植物材料
• 4.1.2 实验试剂及培养基配方
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 试验方法
• 6-PEMG1p在大肠杆菌中的表达和纯化'>4.2.1 His₆-PEMG1p在大肠杆菌中的表达和纯化
• 6-PEMG1p诱导水稻稻瘟病抗性和油菜菌核病抗影响'>4.2.2 His₆-PEMG1p诱导水稻稻瘟病抗性和油菜菌核病抗影响
• 6-PEMG1p对水稻和油菜防御相关指标影响'>4.2.3 His₆-PEMG1p对水稻和油菜防御相关指标影响
• 6-PEMG1p对种子萌发,幼苗根系活力和幼苗茎长的影响'>4.2.4 His₆-PEMG1p对种子萌发,幼苗根系活力和幼苗茎长的影响
• 4.2.5 稻瘟菌激发子pemg1基因在大肠杆菌中的表达的步骤
• 6-PEMG1p的纯化步骤'>4.2.6 His₆-PEMG1p的纯化步骤
• 6-PEMG1p在大肠杆菌中表达的验证'>4.2.7 His₆-PEMG1p在大肠杆菌中表达的验证
• 4.2.8 稻瘟病病情指数的统计
• 4.2.9 POD和PAL活性的测定步骤
• 6-PEMG1p诱导水稻防御相关基因表达的影响'>4.2.10 His₆-PEMG1p诱导水稻防御相关基因表达的影响
• 4.2.11 发芽率,根系活力,根系活力茎长和光合作用强度的测定步骤
• 4.2.12 双向电泳及质谱鉴定的步骤
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 最优表达条件的确定
• 6-PEMG1p的纯化'>4.3.2 His₆-PEMG1p的纯化
• 6-PEMG1p对水稻PAL和POD的影响'>4.3.3 His₆-PEMG1p对水稻PAL和POD的影响
• 6-PEMG1p处理对水稻防御相关基因的激活'>4.3.4 His₆-PEMG1p处理对水稻防御相关基因的激活
• 6-PEMG1p处理对水稻抗稻瘟菌的影响'>4.3.5 His₆-PEMG1p处理对水稻抗稻瘟菌的影响
• 6-PEMG1p诱导水稻叶片蛋白表达的变化'>4.3.6 His₆-PEMG1p诱导水稻叶片蛋白表达的变化
• 6-PEMG1p对油菜种子萌发及幼苗生长的影响'>4.3.7 His₆-PEMG1p对油菜种子萌发及幼苗生长的影响
• 6-PEMG1p处理对油菜的光合作用的影响'>4.3.8 His₆-PEMG1p处理对油菜的光合作用的影响
• 6-PEMG1p对油菜抗菌核病的影响'>4.3.9 His₆-PEMG1p对油菜抗菌核病的影响
• 6-PEMG1p对油菜叶蛋白表达的影响'>4.3.10 His₆-PEMG1p对油菜叶蛋白表达的影响
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 英文缩略表
• 资助项目
• 发表文章
• 致谢
• 作者简历