论文摘要
天然产物是一类非常重要的药学活性成分,2001-2005年间,有23种治疗细菌、真菌感染、癌症、糖尿病、高血脂、皮炎、Alzheimer’s症等疾病的天然产物药物面世。从天然产物中分离单体并衍生化是获得新药的重要手段之一。全世界每年有数以千计新的单体从天然产物中分离出来,又有更大量的衍生物被合成出来。要从浩如烟海的天然产物中选出适合的先导药物,快速准确的高通量筛选至关重要。常规的筛选方法,如动物筛选法、细胞筛选法、受体筛选法、酶筛选法等实验周期较长、对实验设备有较高要求,应用于天然产物的快速、高通量筛选有一定的局限性。本文构建了一种高通量筛选天然产物的荧光脂质体模型。模型筛选原理如下:药物的生物膜通透性与其活性密切相关,用脂质体模拟生物膜,通过测定药物对包封在脂质体内的荧光探针的荧光淬灭来评价药物的生物膜通透性,根据药物生物膜通透性的大小来筛选药物。本文主要进行了以下几方面的研究工作:1建立了适用于评价天然产物生物膜通透性的荧光脂质体模型从研究药物在生物膜中的通透性角度进行药物活性成分的筛选,是近年来药物筛选研究的新热点。本课题从天然产物被动扩散进入生物膜能力的角度,构建了具有创新意义的天然产物生物膜通透性测定模型。我们建立了能够模拟生物膜的荧光脂质体,用以评价天然产物的生物膜通透性,具体包括:（1）选用三种合适的荧光试剂,DPH、TMA-DPH和NBD,分别位于脂质体的脂双层内部、中部和最外部。当药物进入脂质体的不同部位时会使位于该部位的荧光探针荧光强度变化,由此评价天然产物的生物膜通透性。（2）使用多种材料制备脂质体,从脂质体电位、粒径、荧光强度、数据重现性等方面考察脂质体稳定性,发现DSPG能增强脂质体稳定性,而胆固醇对脂质体的稳定性没有贡献,最终确定了荧光脂质体的最佳组成为DSPG:PC 0.1:1（mol/mol）。所制备的荧光脂质体稳定性好、荧光试剂不易泄漏、试验数据重现性好。2测定了多种天然产物对荧光脂质体模型的荧光影响（1）考察了天然产物与荧光脂质体的作用时间,发现两者混匀10 min后荧光强度稳定,因此在以后的实验中选择10 min为反应时间。考察了2μM、4μM、8μM、12μM、16μM浓度的药物对脂质体荧光的影响,发现4μM药物对脂质体荧光有显著影响,荧光灵敏度较高、信号较稳定,所消耗样品量少,确定4μM为最佳药物浓度。（2）选用了35种结构不同、药理活性不同的天然产物,测定它们对荧光脂质体荧光的影响。亲脂性好的药物对脂质体荧光淬灭较大,亲水性好的药物对脂质体荧光淬灭较小。（3）测定天然产物对荧光脂质体荧光偏振度的影响,发现天然产物会导致脂质体的荧光偏振度上升,脂质体膜流动性减小,并且随着天然产物浓度的增加膜流动性逐渐减小,说明天然产物进入了脂质体膜相中,降低了膜相的流动性。（4）测定天然产物对游离荧光探针DPH-TMA、NBD的影响,发现要极高浓度的天然产物才能使游离的荧光探针产生荧光淬灭,说明天然产物对荧光脂质体的荧光淬灭是由于天然产物进入了脂质体中,在荧光探针附近富集到了较高浓度而产生的。（5）考察了药物对CF脂质体荧光的影响,结果药物对CF脂质体的荧光没有明显改变,表明药物没有破坏脂质体结构。3测定了多种天然产物对荧光红细胞膜的荧光影响（1）用荧光探针DPH和DPH-TMA标记大鼠红细胞膜,得到荧光红细胞膜。（2）测定天然产物对荧光红细胞膜的荧光影响,亲脂性好的天然产物对红细胞膜荧光淬灭较大,亲水性好的天然产物对红细胞膜荧光淬灭较小。（3）比较天然产物对脂质体和红细胞膜荧光的影响,发现两者有较好的相关性,对脂质体荧光淬灭大的天然产物对红细胞膜的荧光淬灭也较大,对脂质体荧光淬灭小的天然产物对红细胞膜的荧光淬灭也较小。在2μM-16μM的浓度范围内,天然产物对脂质体与红细胞膜的荧光淬灭百分率成线性相关,相关性良好。表明脂质体模型可以在一定程度上替代细胞膜,研究天然产物对生物膜的通透性。4测定了多种天然产物的Caco-2细胞表观渗透系数和大鼠小肠吸收系数（1）测定多种天然产物的Caco-2细胞表观渗透系数Papp,Papp与天然产物对红细胞膜和脂质体的荧光淬灭百分率线性相关,相关性都较好。（2）测定多种天然产物的大鼠小肠有效吸收系数Peff,Peff与天然产物对红细胞膜和脂质体的荧光淬灭百分率线性相关,相关性都较好。被动吸收是多数药物的主要吸收方式,被动吸收与药物的生物膜通透性相关,因此药物的吸收与其生物膜通透性相关。荧光脂质体模型可以评价药物的生物膜通透性,理论上也可以评价药物的吸收程度。实验证明,荧光红细胞膜与荧光脂质体模型与药物吸收相关性良好,表明荧光仿生膜可以评价天然产物的吸收。5测定了多种天然产物与白蛋白的结合程度以及结合机理（1）血清白蛋白与药物结合后血液中游离药物会减少,到达靶部位发挥药效的药物量会相应减少,我们首次用荧光脂质体模型来研究药物与白蛋白的结合程度,研究靶细胞与白蛋白对天然产物的竞争结合。（2）蛋白质是生物体内具有重要生理功能的大分子,是药物发挥药效的重要载体和靶分子,我们用荧光法初步研究了天然产物与白蛋白作用的一些机理,对于了解药物发挥药效的作用机制,揭示药物药效的实质内涵具有重要意义。结果实验中所用的天然产物通过疏水作用力、静电引力或氢键、范德华力等结合力自发与白蛋白结合,静态淬灭白蛋白内源性荧光。综合而言,荧光脂质体模型操作简便、对实验条件要求不高,可以在实验室中推广使用。荧光脂质体模型与荧光红细胞膜模型相关性好、与Caco-2细胞模型和大鼠小肠吸收模型相关性好,可以在一定程度上替代这几种模型研究天然产物的生物膜通透性和吸收系数。荧光脂质体模型测定快速、准确、重现性好、所用样品量少,非常适合在天然产物筛选的早期高通量筛选候选药物。
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