论文摘要
目的:肝癌的恶性增殖受到多种因素的影响,其中血管生长对肝癌的生长、转移起重要作用。血管内皮生长因子是一种重要的促血管形成因子,并且还能以自分泌的形式促进肿瘤细胞自身生长,在肝癌的发生、发展、转移及预后等方面均起着重要的作用。因此,阻断VEGF表达可抑制肿瘤血管生成和肿瘤的生长和转移,是肝癌基因治疗的一项重要策略。VEGFmRNA经不同的剪切方式可得到7种不同的同工型,其中VEGF165表达广泛,是最重要的效应分子。本研究试图研究小干扰RNA逆转录病毒载体介导的对人肝癌细胞中血管内皮生长因子基因表达的抑制,为RNAi应用于肝癌的基因治疗奠定基础。方法:①查询针对人VEGFmRNA保守序列的小干扰RNA序列,并根据该序列合成两条相应的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制性酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断连接到线性化的pSUPER.retro.neo载体上,酶切及测序证明载体构建是否成功。②采用脂质体介导的方法将构建成功的载体转染到人肝癌细胞（HepG-2 ）中,用G418筛选获得阳性克隆。③最后用半定量RT-PCR及Western-blot检测VEGF基因在肝癌细胞中的表达,以确定RNAi对VEGF表达的抑制效率。结果:①成功构建了针对VEGFmRNA序列的小干扰RNA逆转录病毒表达载体:pSUPER.retro.neo-VEGF-siRNA。②使用脂质体转染能转录特异小干扰RNA的逆转录病毒表达载体入HepG-2细胞中,经G418抗性筛选获得阳性克隆,半定量RT-PCR和Western blot法检测叭?鸙EGFmRNA及VEGF蛋白表达较对照组明显下降,其受抑制率分别为65%和64%（P<0.05）。结论:成功构建了靶向VEGF基因的小干扰RNA表达载体pSUPER.retro.Neo -VEGF-siRNA,该小干扰RNA逆转录病毒表达载体可显著抑制HepG-2细胞中的VEGF基因的表达,为下一步肝癌的基因治疗提供了理论及实验依据。
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