论文摘要
目的:腹膜间皮细胞是构成腹膜最主要的细胞群体,它在维持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起着重要的作用,腹膜结构的完整与功能的稳定是长期维持性腹膜透析（continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD）治疗的基础。长期腹膜透析治疗可诱导腹膜间皮细胞损伤,进而促进腹膜纤维化的形成,最终导致腹透超滤失败,从而迫使患者退出腹膜透析治疗,因此CAPD相关腹膜纤维化的防治成为了当前国内外学者研究的重点。本研究拟探讨高糖是否刺激体外培养的人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells, HPMCs）发生氧化应激损伤生成活性氧（reactive oxygen species, ROS）及对纤维连接蛋白（fibronectin, FN）表达的影响,同时应用不同浓度的维生素E作为药物对照来观察其在HPMCs发生氧化应激损伤下的保护作用,为腹膜纤维化的防治提供实验依据。方法:从CAPD治疗的慢性肾脏病患者腹膜透析流出液中分离并在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中原代培养人腹膜间皮细胞,第二代细胞应用免疫组化方法进行细胞鉴定,第三代细胞用于实验。分别按照不同的实验要求分成浓度依赖组、药物干预组。采用ELISA法检测HPMCs上清液中FN蛋白水平,采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）半定量分析HPMCs中FNmRNA的基因表达,同时应用流式细胞仪检测细胞内对氧化剂敏感的2,7-二氢二氯荧光素（DCFH）发生氧化所产生的荧光量,从而间接的反映细胞内ROS的水平。分别用三种不同浓度的抗氧化剂维生素E（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L）预处理细胞,观察其对HPMCs内源性ROS生成及FN表达的影响。结果:1.高糖能显著诱导体外培养的人腹膜间皮细胞FN的分泌与基因表达,呈浓度依赖方式（P<0.01）,其中4.25%葡萄糖组（高糖组）诱导人腹膜间皮细胞FN的分泌与基因表达更加明显。2.高糖可明显刺激体外培养的人腹膜间皮细胞内活性氧（ROS）的生成,呈浓度依赖方式（P<0.01）,在30min测定平均荧光强度,其中4.25%葡萄糖组（高糖组）刺激人腹膜间皮细胞ROS生成量最高。3.分别用三种不同浓度的抗氧化剂维生素E预处理细胞,与空白对照组相比,可明显地降低细胞内ROS的生成量,同时显著地抑制FN的分泌与基因表达,呈剂量依赖方式（P<0.01）,其中维生素E（50μmol/L）组抑制更加明显。结论:1.高糖可诱导体外培养的人腹膜间皮细胞FN的分泌与基因表达,维生素E作为抗氧化剂可抑制FN的分泌与基因表达。2.高糖可刺激体外培养的人腹膜间皮细胞ROS的生成,而使细胞发生氧化损伤,维生素E作为为抗氧化剂可降低细胞内ROS的生成。3.此研究揭示维生素E在防治腹膜纤维化发生、发展过程中可能是一种有效的药物,为其在临床上的应用提供可靠的理论依据。