毒麦及其近似种的分子鉴定技术研究

论文摘要

毒麦,属禾本科毒麦属（Lolium）（即黑麦草属）,分布于全世界140多个国家和地区。我国原无毒麦,自1954年首次从保加利亚进口小麦中检出后,通过进口粮食或引种携带传入,现已分布到全国26省、市、自治区。毒麦（包括长芒毒麦和田毒麦）是我国乃至世界各国的重要检疫性杂草,我国自1957年以来,一直将其列为检疫对象。而亚麻毒麦、硬毒麦和多花黑麦草则是我国从进口原粮中截获率最高的三种杂草,他们的种子外观形态非常近似,非专业人员很难鉴定到种。目前国内外对毒麦的检疫鉴定方法主要以形态学为主,而形态学方法的鉴定需要很强的专业知识和鉴定水平,且形态学鉴定需建立在种子是否具有完整的判别特征,对于那些完全丧失或部分丧失了判别特征的种子来说是无法用形态学方法来判定的,而这类情况在检疫实践中占有非常大的比例。因此建立有效、准确、实用、快速的分子生物学检测鉴定方法非常重要。本研究分别采用了PCR-测序、PCR-RFLP、单核苷酸多态性（SNP）技术等三种检测鉴定方法对毒麦及其5个近似种进行分子鉴定技术研究,以其筛选出最佳检测鉴定组合,主要研究内容包括:1.PCR-测序法提取毒麦属6个种的样品DNA,分别采用PCR产物直接测序和克隆测序两种方法,对毒麦属6个种rDNA的ITS区（包括ITS-1,5.8 S rDNA和ITS-2）进行序列测定。结果表明,毒麦属植物ITS序列总长度约为647 bp,其中ITS-1长度为235 bp,5.8S约为267 bp,ITS-2约为145 bp。其中ITS-1,5.8 S rDNA和ITS-2分别有16、7和7个变异位点。变异位点中信息位点22个,特异性识别位点8个,差异显著而稳定,依据这些位点完全可对毒麦属6个近似种加以鉴别。采用邻接法建立的系统发育树与形态学分类基本相符,为毒麦属植物分类鉴定提供了重要的分子生物学检测鉴定依据。2.PCR-RFLP法本研究首次应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,根据ITS区测序结果,对毒麦及其5个近似种的rDNA ITS区进行PCR-RFLP分析。选取三种限制性内切酶（BssSI、TfiI、NheI）对毒麦及其5个近似种进行有效酶切,应用PCR-RFLP分析技术对三种内切酶产生的酶切图谱进行分析得出结果:TfiI识别酶切位点G↓AWTC（56,301）,可以将毒麦和硬毒麦两个种完全分开并鉴定出毒麦;BssSI识别酶切位点C↓ACGAG（29）,和TfiI可以鉴定出亚麻毒麦;NheI识别酶切位点G↓CTAGC（185）,结合TfiI可以鉴定出多花黑麦草。因此,应用PCR-RFLP技术能有效将毒麦、亚麻毒麦、硬毒麦、多花黑麦草这四个近似种鉴别区分开,从而建立了毒麦及其近似种的PCR-RFLP分子检测鉴定方法。3.单核苷酸多态性（SNP）技术应用单核苷酸多态性（SNP）技术,首次设计合成并筛选了四套SNP TaqMan-MGB探针（Du-57、Long-555、Ri-302、Tian-31）对毒麦及其近似种的单碱基变异进行检测分析,运用SDS 2.3软件分析等位基因鉴别试验结果,结果表明:探针Du-57能将毒麦与其它种分开;Long-555探针则可以鉴定长芒毒麦;Ri-302探针可以鉴别硬毒麦;Du-57和Tian-31探针结合能将亚麻毒麦和其它近似种区分。单核苷酸多态性（SNP）技术在近似种鉴定上具有稳定性高,读数方便,同时可检测上百个数据,具有基因芯片检测技术等高通量特点,适用于大规模样品的的筛查,缩短了检疫鉴定时间,为毒麦属植物单核苷酸多态性研究提供了有力证据。本文应用三种分子生物学实验方法,结果表明rDNA ITS区序列特征能较好地反映毒麦属种内和种间差别,为毒麦属的鉴别提供了良好的分子标记,为我国检疫性有害生物提供了经济、快速、准确的检疫鉴定方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 文献综述
• 2.1 分子系统学研究进展
• 2.2 植物分子系统学研究进展
• 2.3 植物分子生物学在杂草分类与种类鉴定中的应用
• 2.4 毒麦属形态分类学描述
• 3 立题依据和意义
• 4 研究的主要内容
• 4.1 研究内容
• 第二章 毒麦及其近似种的PCR测序检测法
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 电泳图片
• 2.2 序列比对
• 2.3 序列相似性比较与系统树分析
• 3 讨论
• 3.1 种子基因组DNA的提取
• 3.2 测序过程中影响因素
• 3.3 克隆及阳性质粒的应用
• 3.4 PCR产物直接测序和克隆测序结果比较
• 第三章 毒麦及其近似种的PCR-RFLP法初步分析
• 1 概述
• 1.1 RFLP技术的基本原理
• 1.2 PCR-RFLP技术的基本原理
• 2 材料和方法
• 2.1 材料及试剂
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 RDNA ITS区的PCR扩增
• 3.2 RDNA ITS区的RFLP分析
• 4 讨论
• 4.1 限制性内切酶酶切注意事项
• 4.2 凝胶电泳操作注意事项
• 4.3 RFLP分子标记技术的优缺点
• 4.4 RFLP分子标记技术在杂草研究中的应用
• 4.5 展望
• 第四章 SNP技术对毒麦及其近似种的分型研究
• 1 概述
• 1.1 SNP的概念
• 1.2 SNP的特点
• 1.3 等位基因鉴别技术的定义和原理
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 SDS软件分析数据
• 3.2 SNP分型实验检测结果
• 4 讨论
• 4.1 TAQMAN-MGB探针的优势
• 4.2 SNP技术在植物检疫上的应用优势
• 4.3 实时荧光检测注意事项
• 4.4 SNP检测技术与其它检测技术分析
• 4.5 单核苷酸多态性的现状与发展前景
• 4.6 直接测序、PCR-RFLP、TAQMAN三种检测技术比较
• 结论
• 全文总结
• 图版
• 参考文献
• 缩写词表
• 致谢
• 作者简介