含有CpG基序的PRRSV ORF5基因的真核重组表达载体的构建及其免疫反应的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的病毒性传染病。细菌DNA具有广谱的免疫刺激作用,实验证明人工合成的CpG-ODN可以模拟细菌DNA诱发机体产生强烈的Th1型免疫应答。CpG-ODN作为一种新型的免疫佐剂已成为分子免疫学研究的热点之一。在本研究中,首先筛选出对猪具有最强免疫刺激活性的CpG-ODN,将PRRSV ORF5基因克隆至哺乳动物真核表达载体pVAX1,构建了pVAX1-ORF5真核重组质粒;将优选的CpG-ODN插入到pVAX1-ORF5中,构建成含有CpG基序的真核重组载体质粒CpG-pVAX1-ORF5。为了进一步检测其免疫原性,进行SPF小鼠动物试验,检测其免疫反应指标。用CpG-pVAX1-ORF5免疫仔猪,检测对本体动物的免疫保护效果。1、不同序列的CpG-ODN对猪体外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的研究:为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）,人工设计合成了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞,进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数（SI）,筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:九种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显（SI=3.5）,CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大（SI=2.7）。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。2、含CpG序列PRRSV SD1 ORF5基因真核表达载体的构建与表达:本研究利用已构建的PIRORF5S-ORF5重组质粒,重新设计酶切位点,将ORF5基因插入哺乳动物表达载体pVAX1中,构建出pVAX1-ORF5质粒。再将CpG-ODN6和CpG-ODN7有机组合,人工设计合成CpG-ODN序列,通过在其两端的粘性酶切末端定向插入到经相同酶切处理的真核表达质粒pVAX1-ORF5,成功构建含特定CpG序列的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。将重组质粒转染COS7细胞,经间接免疫荧光试验（IFA）证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。构建成功的表达PRRSV GP5的DNA重组质粒,为研究其所诱导的免疫反应的效果和强度以及对猪体产生的保护性反应奠定基础。3、真核重组表达载体质粒CpG-pVAX1-ORF5免疫原性的研究:通过小鼠试验对CpG-pVAX1-ORF5真核重组表达载体质粒进行了免疫原性检测。免疫体重约22-26克SPF小鼠,检测体液免疫与细胞免疫水平。通过ELISA法检测鼠血清中抗猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒抗体水平,并用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞的CD4+、CD8 +数值,用MTT法检测淋巴细胞增殖指数（SI）,试验结果表明:CpG-ODN能显著提高鼠的特异性抗体滴度以及淋巴细胞增殖反应。4、真核重组表达载体质粒CpG-pVAX1-ORF5对猪体免疫作用研究:通过猪体试验对含CpG-pVAX1-ORF5 DNA疫苗进行了免疫效力评价和病毒保护性试验。在猪体进行了免疫试验。检测猪PRRSV的特异性抗体滴度、IL-2水平以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平,并做了攻毒保护试验。试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1- ORF5能诱导产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫（显著的淋巴细胞增值反应水平）。攻毒结果表明CpG-pVAX1-ORF5组能够有效地抵抗经鼻攻毒,可以保护猪轻微病毒血症,比对照组减少80%,也不表现临床症状,对肺的损害能提供部分保护。CpG的加入可使免疫猪的病变减轻或消失。从而表明含有CpG-ODN能作为PRRSV DNA疫苗的有效佐剂。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、前言
• 二、文献综述
• 2.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的研究进展
• 2.1.1 病原学特性
• 2.1.2 流行病学特点
• 2.1.3 临床症状
• 2.1.4 发病机制及病理变化
• 2.1.5 PRRSV 的持续感染
• 2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的分子生物学研究进展
• 2.2.1 病毒的基因组结构
• 2.2.2 病毒基因组的表达及所编码的蛋白
• 2.2.3 病毒变异与基因重组
• 2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的免疫
• 2.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的体液免疫
• 2.3.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的细胞免疫
• 2.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）疫苗的研究进展
• 2.4.1 灭活油剂疫苗
• 2.4.2 弱毒疫苗
• 2.4.3 基因疫苗
• 2.5 提高基因工程疫苗免疫效果的策略
• 2.5.1 CpG-ODN 的细胞激活作用
• 2.5.2 CpG-ODN 的生物体内效应
• 2.5.3 对天然免疫的刺激效果
• 2.5.4 对获得性免疫反应的刺激效果
• 2.5.5 CpG-ODN 免疫刺激增强作用的机制
• 2.5.6 CpG-ODN 生物学活性的投递运载工具
• 2.5.7 CpG ODN 作为新型免疫佐剂的前景及用途
• 三、实验部分
• 实验一：不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 CpG-ODN 的合成
• 1.1.2 试验动物
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 猪外周血、脾脏的采
• 1.2.2 外周血淋巴细胞的分离培养
• 1.2.3 脾脏免疫细胞的分离
• 1.2.4 活力检测与计数
• 1.2.5 外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞增殖试验（MTT 法）
• 1.2.6 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 不同序列 CpG-ODN 对猪外周血淋巴细胞的刺激作用的结果分析
• 2.2 不同序列CpG-ODN 对猪脾细胞的刺激作用的结果分析
• 实验二：含CpG 序列 PRRSV SD1 ORF5 基因真核表达载体质粒构建及
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒及工程菌
• 1.1.2 所用引物
• 1.1.3 CpG-ODN序列
• 1.1.4 主要试剂和仪器
• 1.1.5 细胞和抗原
• 1.1.6 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 PCR 扩增ORF5 基因
• 1.2.2 ORF5 基因的纯化
• 1.2.3 pVAX1-ORF5 载体的构建
• 1.2.4 CpG-pVAX1-ORF5 重组质粒的构建
• 1.2.5 CpG-pVAX1-ORF5 重组质粒质粒的序列测定
• 1.2.6 重组质粒的纯化和转染细胞
• 1.2.7 重组质粒转染细胞
• 1.2.8 间接免疫荧光实验（IFA）
• 1.2.9 基因的转录鉴定
• 1.3 免疫小鼠
• 1.3.1 免疫用质粒DNA 的制备
• 1.3.2 实验分组
• 1.3.3 脾T 淋巴细胞的制备
• 1.3.4 脾T 淋巴细胞亚群数量的检测
• 1.3.5 淋巴细胞转化试验
• 1.4 免疫小鼠血清抗体检测
• 2 结果
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.1.1 PCR 扩增结果
• 2.1.2 pVAX1-ORF5 和CpG-pVAX1-ORF5 重组质粒的鉴定
• 2.1.3 CpG-pVAX1-ORF5 测序鉴定
• 2.2 质粒CpG-pVAX1-ORF5 的转染与RT-PCR 鉴定基因的转录
• 2.2.1 质粒 CpG-pVAX1- ORF5 的体外表达
• 2.3 T 细胞亚类数量的检测
• 2.4 小鼠外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞转化试验（MTT 法）
• 2.4.1 小鼠外周血淋巴细胞的刺激作用的结果分析
• 2.4.2 小鼠脾脏细胞的刺激作用的结果分析
• 2.5 实验小鼠血清中 PRRSV 特异性抗体测定
• 实验三：含 CpG 序列 PRRSV SD1 ORF5 基因真核表达载体质粒对猪体免疫作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 病毒和抗原
• 1.3 质粒和引物
• 1.4 主要试剂和仪器
• 1.4.1 试剂
• 1.4.2 主要仪器
• 1.4.3 溶液的配制
• 1.5 实验动物分组及免疫
• 1.6 攻毒
• 1.7 淋巴细胞转化试验
• 1.7.1 淋巴细胞悬液的制备
• 1.7.2 实验猪淋巴细胞增值反应的测定
• 1.7.3 数据处理
• 1.8 免疫血清特异性抗体和中和抗体的检测
• 1.8.1 血清特异性抗体的检测
• 1.8.2 血清的中和抗体的检测
• 1.9 IL-2 的定量检测
• 1.9.1 准备工作
• 1.9.2 试验步骤
• 1.10 实验猪PRRSV的RT-PCR检测和病理学观察
• 1.10.1 临床观察
• 1.10.2 病理组织切片观察
• 2、结果
• 2.1 实验猪淋巴细胞增殖反应的测定
• 2.2 血清的 ELISA 抗体水平和中和抗体水平的检测
• 2.2.1 血清的 ELISA 抗体水平
• 2.2.2 特异性中和抗体效价的测定
• 2.3 重组质粒对猪血清中 IL-2 浓度的影响
• 2.4 实验猪PRRSV 的RT-PCR 检测和病理学观察
• 2.4.1 免疫猪攻毒后4 周的临床症状和病理变化
• 2.4.2 组织和血清中 PRRSV 核酸的检测
• 2.4.3 病理切片观察
• 四、讨论
• 4.1 淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行体外筛选不同CpG-ODN序列的讨论
• 4.2 不同长度的 CpG-ODN 活性不同的机制探讨
• 4.3 对 CpG 骨架进行了硫代修饰必要性的讨论
• 4.4 关于PRRSV ORF5 基因免疫方面的研究
• 4.5 在构建DNA疫苗时，载体的选择是一个很关键的问题
• 4.6 真核重组表达质粒表达外源基因水平的讨论
• 4.7 CpG-ODN 免疫增强活性的讨论
• 4.8 CpG-ODN 对猪体攻毒保护试验的讨论
• 4.9 PRRSV 攻毒试验中对猪体造成病理损伤及致病机制的探讨
• 4.10 CpG-ODN 的研究意义和发展前景的讨论
• 五、结论
• 六、参考文献
• 七、附录
• 八、致谢
• 九、在博士期间发表录用的文章及获奖情况