论文摘要
目的研究角花胡颓子中总皂苷的最佳提取工艺。方法经过香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸显色后,采用分光光度法测量吸光度,并且用熊果酸作对照品,计算角花胡颓子中总皂苷的含量。采用正交实验,以角花胡颓子中总皂苷得率为评价指标,研究乙醇浓度,乙醇用量,提取次数,回流时间对皂苷得率的影响,优化角花胡颓子的提取工艺。结果根据熊果酸标准品溶液及供试品溶液最大吸收峰,选择541nm作角花胡颓子总皂苷的测定波长。经过香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸显色后,利用紫外分光光度法,显示在30.4~152μg的范围内熊果酸含量与吸光度呈良好的线性关系,且回归方程为y=0.0052x+0.0313。根据标准曲线计算角花胡颓子中总皂苷含量,并检验该显色和测量方法的精密度试验:RSD=1.99%;稳定性试验:RSD=0.57%;重复试验:RSD=2.48%;加样回收实验:RSD=2.78%。正交实验结果显示:角花胡颓子的最佳提取工艺为70%的乙醇浓度,溶剂用量为药材的10倍,回流时间为90min,提取2次,在该工艺下,总皂苷得率可达到4.64(mg/g)。结论0.4ml5%香草醛-冰醋酸溶液和1ml高氯酸显色后,并利用紫外分光光度法测吸光度,用此显色和检验方法计算角花胡颓子总皂苷的含量时稳定可靠。且正交实验表明角花胡颓子总皂苷的最佳提取工艺为:乙醇浓度70%,溶剂用量与药材的比值为10:1,乙醇回流时间90min,总共提取2次。目的观察角花胡颓子醇提物对小鼠的急性毒性实验,并研究角花胡颓子醇提物抗炎作用及其机制,为临床应用提供实验依据。方法采用最大耐受法研究角花胡颓子醇提物的急性毒性;采用急性炎症模型,二甲苯致小鼠耳肿张及增加皮肤毛细血管通透性,角叉菜胶致大鼠足肿胀和慢性炎症模型棉球诱导大鼠肉芽组织增生的实验模型观察抗炎作用;采用紫外分光光度计测定角叉菜胶致炎足炎性渗出物中PGE2;荧光分光光度,测定炎性渗出物中组胺的相对含量。结果(1)小鼠一次灌胃的最大耐受量为1406.277g(生药)/kg. W。(2)角花胡颓子醇提物各剂量组对二甲苯诱发小鼠耳肿张及皮肤毛细血管通透性均有明显的抑制作用(均有P<0.05),且对耳肿张的抑制作用角花胡颓子醇提取的高剂量组与阿司匹林组差异无显著性(P>0.05)。(3)角花胡颓子各剂量组在致炎后2h显示出对足肿胀的明显抑制作用(均有P<0.05),并持续到致炎后4h。(4)与对照组比较角花胡颓子醇提物高、中剂量组能显著降低大鼠角叉菜胶炎性渗出物中PGE2和组胺的含量(均有P<0.05)。(5)角花胡颓子各剂量组能明显抑制棉球引起的肉芽组织增生(均有P<0.05),且抑制效果与剂量成正相关。高剂量组与地塞米松组比较效果相当(p>0.05)。剂量资料用x±SD表示,采用spss18统计软件进行分析。预先Hemogeneity of variances进行方差齐性检验,如方差齐采用LSD法进行比较;不齐采用TamhaneˊT2非参数法进行比较。P<0.05差异有显著性,P<0.01差异有极显著性。结论角花胡颓子经口给药毒性低,临床用药安全;角花胡颓子醇提物具有显著的抗炎作用,且抗炎程度与组织中PGE2和组胺含量成负相关。用角花胡颓子醇提物治疗后,观察支气管哮喘小鼠一般生活状态、肺组织形态学及相关细胞因子等相应指标变化。研究角花胡颓子醇提物对支气管哮喘小鼠的治疗作用及机制,为临床用药提供实验依据。方法将60只,BABL/c小鼠按体重随机平均分成:正常对照组,哮喘模型组,角花胡颓子醇提物高、中、低剂量组和地塞米松阳性对照组,用卵白蛋白混悬液腹腔注射致敏3次,常规饲养数日后雾化吸入卵白蛋白连续激发7次制备小鼠哮喘模型。于末次雾化后24h处死小鼠,分别用瑞氏染色分类炎性细胞和用计数板计数小鼠右肺支气管肺泡灌洗液中炎症细胞。再将左肺下叶置于4%多聚甲醛内固定24h,常规脱水包埋切片,然后进行三种染色分别为:苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织一般病理学改变,用QWIN软件测量单位长度基底膜周径上的支气管壁面积(Wat/pbm);马松(masson)染色观察肺组织纤维化程度,测量单位长度基底膜周径的胶原面积(Wcol/pbm);过碘酸-希夫氏(PAS)染色观察气道杯状细胞增生及黏液分泌情况,积分法进行半定量评价杯状细胞数目的增生情况,在一个高倍视野下计算杯状细胞占上皮细胞总数的比例<5%为0分,≥5%~<25%为1分,≥25%~<50%为2分,比例在≥50~<75%为3分,比例≥75%为4分;用QWIN软件测免疫组化切片中阳性区域的平均吸光度值来评价肺组织中转化生长因子B1(TGF-β1)和白细胞介素4(IL-4)的表达情况。结果哮喘组小鼠病理切片显示:肺组织炎细胞大量浸润,胶原蛋白大量沉积,气道杯状细胞明显增生,并且伴粘液过度分泌严重时粘液阻塞气道。另外,BALF中炎症细胞总数,嗜酸性粒细胞数, Wat/pbm、Wcol/pbm增高,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05);角花胡颓子醇提物高、中剂量可明显抑制炎细胞浸润至肺组织,胶原蛋白大量沉积,气道杯状细胞明显增生及粘液过度分泌。BALF中炎症细胞总数,嗜酸性粒细胞数, Wat/pbm、Wcol/pbm增高,与哮喘组比较差异有统计学意义(均有P<0.05)。且高剂量组与地塞米松组差异无显著性(P>0.05)。哮喘组肺组织中TGF-β1和IL-4蛋白的表达较对照组增加(P<0.05);角花胡颓子醇提物高、中剂量组肺组织中TGF-β1和IL-4蛋白的表达下降,与哮喘组比较差异均有统计学意义(p<0.05);但高剂量组与地塞米松组差异无显著性(P>0.05)。剂量资料用x±SD表示,采用spss18统计软件进行分析。结论角花胡颓子可减轻哮喘小鼠的气道炎症和气道重塑,其机制可能和抑制肺组织中TGF-β1和IL-4蛋白的表达有关。
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