论文摘要
B7家族分子主要包括B7-1和B7-2,B7分子表达于单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞等。B7-1和B7-2的受体分子为表达于T细胞表面的CD28家族分子（CD28和CTLA-4）。1989年,Freeman首次克隆出B7-1的cDNA并进行了序列分析,随后又克隆出B7-2的cDNA。B7-2基因定位于第3号染色体（3q21）,长度为1120bp,编码的蛋白为306个氨基酸。B7-2分子参与介导T细胞的活化,提供T细胞免疫效应所需的协同刺激信号,同时也参与肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病及移植排异等病理过程。B7-2转基因细胞的构建及单克隆抗体的研制在B7分子相关的基础与临床研究中具有重要的意义。 1.B7-2基因的克隆及转基因细胞的建株 采用RT-PCR方法,从成熟DCs的总RNA中扩增出编码人B7-2全长的cDNA片段,通过基因克隆技术,将其插入逆转录病毒载体pEGZ-Term。通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T,用293T培养上清感染L929细胞,培养72h。经Zeocin筛选及间接免疫荧光法进一步鉴定,获取稳定表达B7-2分子的L929细胞株（L929/B7-2）。经体外长期传代培养和液氮冻存,L929/B7-2生长良好,B7-2分子的阳性表达率稳定在97%以上。 2.鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制 2.1 分泌抗人B7-2单抗杂交瘤细胞的建株 以L929/B7-2为免疫原,采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠（BALA/c）的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用HAT选择培养基培养。用间接免疫荧光法进行抗体检测。以L929/B7-2为阳性筛选细胞株,以转空质粒的L929/mock为阴性对照。用有限稀释法进行阳性杂交瘤的亚克隆化培养。共获取5株持续、稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、6C8、2H6、3A7和7H9。经快速定性试纸法鉴定,1F9的重链为IgG1;3A7的重链为IgG2a;6C8、2H6和7H9的重链均为IgG2b,5株单抗的轻链均为κ。体外持续培养3个月以上和液氮冻存后复苏,杂交瘤细胞生长良好,分泌抗体的性能稳定。
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