论文摘要
细胞在多种内外环境及化学物质不断攻击下会诱发DNA损伤。为了维持基因组的稳定性,细胞内拥有一系列相互独立又密切联系的完善而精确细胞应答机制来应对这些损伤。细胞首先通过DNA损伤检查点,启动细胞周期阻滞,进一步实施DNA修复或细胞凋亡。那么,在DNA损伤介导的细胞应激反应中,诸多主要应答反应,包括细胞周期阻滞、DNA损伤修复、细胞凋亡或突变产生等机制是如何有序的发生及转换的,调控这些途径的信号机制如何?这些问题的回答无疑是深入解析DNA损伤后细胞应答过程的关键,同时也可以为进一步阐明真核细胞DNA损伤修复的调节的复杂机制提供依据,并且对于研究该机制与基因突变、癌症的发生发展及肿瘤的治疗等方面提供新思路。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）是一种表达水平随细胞周期波动高度保守的生长调控蛋白,可围绕DNA链组装成三聚体滑动夹,是DNA聚合酶（polymerase,pol）polδ和polε的辅助因子。滑动夹PCNA能够以一定的秩序与多种蛋白如P21、XPG、CyclinD、Gadd45（growth arrest and DNA damage gene, Gadd）及多种DNA聚合酶等结合,实现对DNA的复制、损伤修复、细胞周期调控及凋亡等事件的协同。如PCNA与P21的结合对于细胞凋亡的发生至关重要,而DNA损伤后重要的核苷酸切除修复过程则依赖与PCNA与XPG分子的结合。对PCNA相互作用蛋白研究发现,它们都存在一个保守的PCNA结合区域-PIP box（PCNA interaction protein）,并且大多数PCNA相互作用蛋白均竞争结合于PCNA的相同位点。实验表明:在DNA遭受损伤后,PCNA可通过结合、协同不同的蛋白分子从而启动和转换DNA损伤后细胞应激的诸多不同反应,介导细胞DNA不同途径或转归,在细胞应答反应中发挥着重要的中枢调度（crossroad）作用。因此,围绕PCNA及其在细胞损伤应答中相关功能开展深入研究很有意义,不仅有助于阐明PCNA在细胞应激反应中的作用及机制,而且对于我们了解细胞应激网络各反应过程的内在联系,最终深入理解肿瘤发生、发展及治疗等具有重要而深远的理论意义。近年来,大量研究表明蛋白质的多种翻译后修饰可参与调控蛋白质的生理活动,PCNA作为2002年第一个发现并证实非经典泛素化途径（不引起蛋白的降解）修饰的蛋白,其泛素化修饰的研究一直是一个热点。研究表明,在DNA损伤条件下,PCNA K164位点可发生泛素化。在酵母系统中,现已证实在UV损伤下PCNA K164位点单泛素化可调控与PCNA结合的DNA聚合酶从polδ转换至跨损伤复制酶polη,介导polη向损伤部位聚集,从而启动polη介导的具有错配倾向的跨损伤复制过程。虽然近年研究发现PCNA K164位点的泛素化修饰参与介导了DNA的损伤应答反应过程,但是应激反应中各个事件之间的内在联系与相互转换规律仍不十分明确,还需要通过进一步的试验研究去探索和完善这一机制。在众多外源性DNA损伤因素中,以紫外（UV）和顺铂（cisplatin）研究的最多。紫外照射主要形成干扰DNA复制的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和6-4光产物,主要通过核苷酸切除（Nucleotide Excision Repair,NER）过程进行DNA修复;顺铂作为临床上常用的化疗药物,其主要是通过形成铂-DNA加合物并造成DNA链内或链间交联阻滞DNA复制,其修复途径除了NER外,还涉及错配修复、同源重组等。目前有关PCNA泛素化的研究多采用紫外线照射损伤为模型,且大多集中于探讨PCNA泛素化在募集错配倾向DNA聚合酶及在跨损伤复制中的作用。由于UV与顺铂损伤的作用机理有一定的相似性,因此我们推测PCNA K164位点的泛素化修饰也有可能参与介导了顺铂所诱导的DNA损伤应答过程。那么PCNA泛素化修饰是否在顺铂所诱导的DNA损伤应答中也发挥了重要的作用,或者这种应激反应只具有DNA损伤类型的特异性?PCNA泛素化在DNA诱导的细胞应激反应是否仅限于启动跨损伤复制和复制后修复?在其它应激反应中,如细胞周期调控、细胞凋亡或DNA修复过程是否同样也发挥着协同或拮抗作用?由于单一采用UV损伤为模型来研究PCNA泛素化调控细胞损伤应答机制具有一定的局限性,同时为探讨PCNA泛素化的生物学作用是否具有DNA损伤的特异性,我们选用了损伤应答过程更为复杂的顺铂作为DNA损伤因素。另一方面,作为常规化疗药物,选择顺铂损伤开展研究,有助于进一步深入了解顺铂耐药性及诱导高突变产生等机制,从而具有重要的现实意义。基于以上分析,本课题主要围绕PCNA泛素化修饰与顺铂损伤应答相关机制进行了实验设计和研究,采用显性负突变策略（dominant negative mutant）,通过构建PCNA泛素化位点（K164）点突变体mPCNA,及其拮抗性阻断PCNA泛素化的细胞模型;MTT法、克隆形成及Annexin V和PI双染法检测PCNA泛素化对细胞敏感性及凋亡的影响;体内luciferase报告基因宿主反应实验检测DNA损伤修复能力;流式细胞术检测顺铂处理后细胞周期演进情况;体内突变检测系统检测顺铂诱发突变产生等技术和方法在细胞系水平来初步探讨PCNA泛素化修饰在顺铂诱导的DNA损伤应答反应中的各主要反应中的可能的生物学功能。本实验为进一步阐明PCNA泛素化修饰在DNA损伤应答中重要的生物学作用提供重要的研究线索。方法:1.重组人PCNA及其突变体mutant PCNA（mPCNA）真核表达质粒的构建及鉴定:以质粒pTAP-PCNA为模板进行PCR扩增,得到人PCNA的相应序列。将该序列片断克隆至pGEM-T Easy载体中,经蓝白斑筛选,获得重组质粒pGEM-T Easy PCNA,回收PCNA目的片断。以测序正确的重组质粒pGEM-T Easy PCNA为模板采用一步反向PCR致突变法对重组质粒进行扩增、连接,并经双酶切回收mutant PCNA目的片段,行序列测定。将真核表达载体pCDNA3.1/V5-His A双酶切并回收目的片断,将含有正常及定点突变的PCNA序列定向克隆至该表达载体上,得到重组人PCNA及其突变体的真核表达质粒,分别命名为pCDNA3.1/V5-His A-PCNA和pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA。western blot方法检测目的蛋白是否能够表达。2. PCNA及其突变体mPCNA稳定高表达Hela细胞系的建立2.1 PCNA及mPCNA真核表达质粒稳定转染Hela细胞:将Hela细胞经胰酶消化后,接种于35mm培养板中,24小时贴壁后,参照lipofectamineTM 2000脂质体操作说明,将lipofectamineTM2000-DNA复合物加入培养板中,进行稳定筛选。稳定建系后,提取细胞总蛋白,进行western blot方法显色分析,并挑选出表达量最高的阳性克隆。2.2顺铂诱导PCNA泛素化修饰的检测:将稳定高表达PCNA及mPCNA的Hela细胞消化铺板,24小时贴壁后,加入顺铂使终浓度为15μmol/L,药物作用4小时后,PBS洗3遍,加入不含药物的培养基继续培养24 h,收取细胞全蛋白,以鼠抗人his抗体为一抗,以标记了HRP的羊抗鼠IgG为二抗,进行western blot方法显色分析。3. PCNA泛素化修饰对细胞顺铂敏感性及细胞凋亡的影响3.1 MTT法检测细胞顺铂敏感性:将对数生长期的野生型Hela细胞及稳定转染的PCNA、mPCNA的Hela细胞,经胰酶消化后以适当浓度接种于96孔板中,第二天贴壁后,加入不同浓度的顺铂（5个复孔）设立阳性对照组及试验组。药物作用4小时后,PBS洗三遍,换入不含药物的培养基继续培养至24小时后,加入MTT（5mg/ml）20ul/孔。培养4小时后,翻板法倒尽板内液体,每孔再加入150ulDMSO,充分混匀,492nm测OD值,计算细胞的存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。3.2克隆形成法检测细胞顺铂敏感性:将野生型Hela细胞及稳定转染PCNA、mPCNA的Hela细胞,经胰酶消化后以1000个/孔的密度接种于6孔板中。第二天贴壁后,加入不同浓度的顺铂,作用4小时后,PBS洗三遍,换入不含药物的培养基继续培养约2周,直到长出肉眼可见克隆时,用PBS洗两遍,再用无水甲醇固定15分钟,弃去,姬姆萨染色20min,计数大于50个细胞的克隆数,并计算克隆形成率。克隆形成率（%） =克隆数/接种数×100%。3.3细胞凋亡的检测:将野生型Hela细胞及稳定高表达mPCNA的Hela细胞消化铺板,24小时贴壁后,加入顺铂使终浓度分别为15μmol/L和20μmol/L,药物作用4小时后,PBS洗3遍,再加入不含药物的培养基分别作用12 h和24 h后收取细胞。Annexin V–FITC和PI双染法检测分析细胞凋亡。4. PCNA泛素化修饰对DNA损伤修复能力的影响:用顺铂在体外将PUG15-Luc质粒进行损伤,剂量为100μmol/L,时间为4h,重新将质粒进行提取和纯化。损伤后的质粒瞬时转染入野生型Hela细胞及稳定高表达PCNA及mPCNA的Hela细胞,以未损伤的质粒为阳性对照,继续培养使质粒得以充分修复和表达。48h后裂解细胞,检测Luciferase报告基因的表达,并计算相对损伤修复率（%）=损伤质粒Luc RLU值/未损伤质粒Luc RLU值×100%。5.PCNA泛素化修饰对DNA损伤后细胞周期阻滞的影响:将野生型Hela细胞及稳定高表达mPCNA的Hela细胞消化铺板,24小时贴壁后,加入顺铂使终浓度为15μmol/L,药物作用4小时后,PBS洗3遍,再加入不含药物的培养基分别作用:12 h、24 h、36 h,后收集细胞流式细胞仪对细胞周期进行检测分析。6. PCNA泛素化修饰对顺铂诱导产生的的基因突变作用机制的研究:用顺铂在体外将含有SupF报告基因的穿梭质粒PSupFG1进行损伤,将损伤后的质粒瞬时转染入野生型Hela细胞及稳定高表达mPCNA的Hela细胞;继续培养使质粒得以充分修复和复制。48小时后,提取细胞内的supF质粒,用DpnⅠ酶切三个小时,然后将其电转入SY204细菌;将细菌铺板在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的平板上,长出蓝白斑,根据蓝白斑数量计算突变频率（%）=白色菌落/白色菌落+蓝色菌落×100%。结果:1.真核表达质粒pCDNA3.1/V5-His A-PCNA和pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA经酶切、测序分析与实验设计的序列完全一致。表达质粒瞬时转染真核细胞后,western blot结果显示在相应位置可见清楚的目的条带。2.提取野生型及稳定转染PCNA和mPCNA的Hela细胞总蛋白,进行SDS-PAGE及western blot分析,结果显示稳定转染的细胞株在约36KD处有明显的特异性条带出现,而没有转染质粒的野生型Hela细胞在36KD处没有条带出现,表明稳定转染成功。相同条件顺铂处理后,western blot检测结果显示:稳定高表达PCNA的细胞在44KD（单泛素化的PCNA）处出现一条泛素化修饰目的条带,而稳定高表达mPCNA的细胞只在36KD（未修饰的PCNA）处有一条目的条带。3. MTT法:不同浓度顺铂作用后,野生型及稳定转染PCNA的Hela细胞存活率从100%降到约82%,稳定转染mPCNA的Hela细胞存活率从100%降到23%,并呈剂量效应关系。克隆形成法:随着顺铂作用时间延长及浓度的增加,野生型及稳定转染PCNA的Hela细胞克隆形成率降到约70%,稳定转染mPCNA的Hela细胞克隆形成率降到18%,其变化趋势与MTT结果基本一致。细胞凋亡:随着顺铂作用时间延长及浓度的增加,野生型Hela细胞的凋亡率从5.18%上升至12.24%,而稳定转染mPCNA的Hela细胞其凋亡率从5.7%上升至36.74%,并呈剂量效应关系。4.根据Luciferase报告基因检测结果,计算出DNA的相对损伤修复率。野生型Hela:25%,Hela-PCNA:22%,Hela-mPCNA:23%。经统计学分析,Hela-mPCNA细胞与对照组相比损伤修复率没有显著差异。5.细胞周期:与未处理的细胞（s:31%,24h）相比,顺铂处理后,野生型Hela细胞出现了明显的S期阻滞（P<0.05）,在24h达到59%,而稳定转染mPCNA的Hela细胞（S:33%,24h）几乎没有S期的阻滞。6.将PSupFG1质粒成功转入野生型及稳定高表达PCNA及mPCNA的Hela细胞,提取出细胞内PSupFG1质粒,然后高效的将其转入SY204细菌,最后铺板数出蓝白斑得出突变频率:WT- Hela:2.58‰; PCNA-Hela:2.54‰;mPCNA-Hela:0.57‰。与对照组相比,稳定高表达mPCNA的Hela细胞其SupF基因突变率明显降低。结论:1.成功建立了拮抗性抑制PCNA泛素化修饰的细胞模型。2. PCNA泛素化修饰参与调控顺铂诱导的细胞凋亡性死亡,从而影响细胞顺铂敏感性。3. PCNA泛素化修饰对顺铂诱导的DNA的损伤修复能力没有显著影响。4. PCNA泛素化修饰可促进DNA损伤后在S期的细胞周期阻滞。5. PCNA泛素化修饰在顺铂诱导产生的DNA损伤应答中,参与诱发基因组DNA高突变的产生。6. PCNA泛素化修饰在DNA损伤应答过程多个重要环节及反应中发挥了重要的作用。
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