新型亲和反胶团系统及其蛋白质萃取特性研究

论文摘要

反胶团萃取技术在蛋白质等生物活性物质的分离领域中被广泛研究。但是传统的离子型反胶团在萃取过程中往往对蛋白质选择性低以及使蛋白质失活,因此本文研制出新型亲和非离子反胶团系统,并对此反胶团系统在蛋白质分离纯化过程中的萃取特性进行了系统的分析研究。通过两液相合成的方法将非离子型表面活性剂（Span 85）分子结合亲和型色素染料辛巴蓝（CB）分子,并以正己烷为溶剂制备出CB-Span 85亲和型反胶团系统。利用水分测定仪和激光光散射仪对亲和反胶团的性质进行研究。结果表明,由于亲和配基CB的引入,CB-Span 85反胶团的含水率（W0）,流体力学半径（Rh）,以及胶团聚集数（Nag）均比Span 85反胶团提高。亲和反胶团对蛋白质的萃取率也随CB浓度的增加而显著增加,说明亲和相互作用在萃取过程中起主导作用。被萃取的蛋白质通过1mol/L NaCl溶液进行反萃,回收得到的蛋白质显示出与天然态蛋白质完全相同的活性和二级结构,证明该亲和反胶团系统良好的生物相容性。助剂对反胶团萃取蛋白质的过程具有显著的影响,因此本文考察了正己醇作为助剂对CB-Span 85亲和反胶团性质及蛋白质萃取的影响。结果表明3 vol.%正己醇可增加反胶团的W0、Rh和Nag,从而使反胶团对蛋白质的萃取率提高16%,并且揭示出正己醇分子几乎参与亲和反胶团系统中每一个反胶团的形成,使反胶团界面层的曲率和硬度降低,界面层的流动性增加。对亲和反胶团系统中蛋白质分配平衡和萃取动力学进行了研究。结果表明蛋白质的分配平衡等温线可用Langmuir方程进行拟合,并且亲和配基CB和助剂正己醇浓度的增加可显著增加亲和反胶团系统的萃取容量。萃取动力学实验结果反映了液膜传质阻力、空间位阻相互作用、亲和相互作用和界面传质阻力这几种因素协同影响CB-Span 85亲和反胶团系统萃取蛋白质的动力学传质过程。最后将CB-Span 85亲和反胶团系统应用于实际蛋白体系的萃取分离。通过一次萃取可以使粗鸡卵清白蛋白中溶菌酶的纯化因子达到23。并且在反胶团相的多次循环利用中,溶菌酶的纯化因子并未随利用次数的增加而显著下降,说明CB-Span 85亲和反胶团系统在分离纯化蛋白质方面具有一定的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 蛋白质分离技术
• 1.2.1 膜分离技术
• 1.2.2 萃取技术
• 1.2.3 色谱分离技术
• 1.2.4 电泳技术
• 1.3 反胶团萃取技术
• 1.3.1 反胶团的形成及其萃取特点
• 1.3.2 反胶团的结构特性及其检测方法
• 1.3.2.1 反胶团的临界胶团浓度
• 1.3.2.2 反胶团大小与聚集数
• 1.3.3 反胶团萃取的影响因素
• 1.3.3.1 水相pH 值
• 1.3.3.2 盐种类和离子强度
• 1.3.3.3 表面活性剂、助表面活性剂、溶剂和助溶剂
• 1.3.3.4 温度和相比
• 1.3.3.5 蛋白质种类及浓度
• 1.3.4 反胶团萃取的动力学研究
• 1.3.5 反胶团萃取的发展现况及存在问题
• 1.4 亲和纯化技术
• 1.4.1 亲和纯化
• 1.4.2 亲和纯化技术的分类
• 1.4.2.1 亲和色谱
• 1.4.2.2 亲和膜分离
• 1.4.2.3 亲和沉淀
• 1.4.2.4 亲和反胶团萃取
• 1.4.3 色素亲和纯化技术
• 1.4.3.1 色素亲和作用原理
• 1.4.3.2 色素亲和作用的影响因素
• 1.4.3.3 近几年色素亲和纯化技术的应用和发展
• 1.5 本文工作的内容及意义
• 1.5.1 研究背景
• 1.5.2 研究的内容及意义
• 第二章 亲和反胶团的制备和性质
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验试剂与设备
• 2.2.2 溶液配制方法
• 2.2.3 亲和配基修饰原理
• 2.2.4 亲和反胶团的制备
• 2.2.5 实验分析
• 2.2.5.1 反胶团含水率的测定
• 2.2.5.2 反胶团粒径和聚集数的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 亲和反胶团的合成
• 2.3.1.1 表面活性剂的筛选
• 2.3.1.2 CB-Span 85 亲和反胶团的UV/VIS 吸收光谱
• 2.3.2 反胶团含水率
• 2.3.2.1 CB 和 Span 85 浓度对亲和反胶团含水率的影响
• 2.3.2.2 pH 值对亲和反胶团含水率的影响
• 2.3.2.3 离子强度和阳离子种类对亲和反胶团含水率的影响
• 2.3.2.4 亲和反胶团临界胶团浓度的研究
• 2.3.3 反胶团粒径
• 2.3.4 反胶团聚集数
• 2.4 小结
• 附图
• 第三章 亲和反胶团萃取蛋白质的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验试剂与设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 亲和反胶团萃取及反萃实验
• 3.2.2.2 萃取收率计算
• 3.2.3 实验分析
• 3.2.3.1 蛋白浓度测定
• 3.2.3.2 溶菌酶活性测定
• 3.2.3.3 园二色分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 萃取的影响因素
• 3.3.1.1 CB 和 Span 85 浓度的影响
• 3.3.1.2 pH 值的影响
• 3.3.1.3 离子强度的影响
• 3.3.1.4 相比和温度的影响
• 3.3.2 反萃条件的确定
• 3.3.3 反萃蛋白质活性
• 3.3.3.1 溶菌酶活性
• 3.3.3.2 园二色光谱图
• 3.4 小结
• 附图
• 第四章 助剂对亲和反胶团系统的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验试剂与设备
• 4.2.2 助剂的添加
• 4.2.3 萃取与反萃取实验
• 4.2.4 实验分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 助剂对亲和反胶团系统含水率的影响
• 4.3.1.1 正己醇对亲和反胶团含水率的影响
• 4.3.1.2 Tween 85 对亲和反胶团含水率的影响
• 4.3.2 正己醇对亲和反胶团的流体力学半径和聚集数的影响
• 4.3.3 助剂对亲和反胶团萃取蛋白质的影响
• 4.3.3.1 正己醇对亲和反胶团萃取蛋白质的影响
• 4.3.3.2 Tween 85 对亲和反胶团萃取蛋白质的影响
• 4.4 小结
• 第五章 亲和反胶团系统中蛋白质的萃取平衡及萃取动力学
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验试剂与设备
• 5.2.2 萃取与反萃取实验
• 5.2.3 实验分析
• 5.3 反胶团萃取动力学
• 5.3.1 萃取平衡方程
• 5.3.2 动力学模型
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 亲和反胶团系统对蛋白质的萃取平衡
• 5.4.2 正己醇对亲和反胶团萃取平衡的影响
• 5.4.3 前萃过程的动力学研究
• 5.4.4 反萃过程的动力学研究
• 5.4.5 转速对萃取动力学的影响
• 5.4.6 助剂的添加对萃取动力学的影响
• 5.5 小结
• 符号表
• 第六章 亲和反胶团萃取实际蛋白物系及其回收再利用
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验试剂与设备
• 6.2.2 溶液配制方法
• 6.2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂的配制
• 6.2.2.2 考马斯亮蓝 G-250 溶液的配制
• 6.2.3 分离纯化溶菌酶
• 6.2.4 实验分析
• 6.2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法
• 6.2.4.2 蛋白浓度的测定
• 6.2.4.3 体积排阻色谱
• 6.2.4.4 溶菌酶活性测定
• 6.2.5 溶菌酶萃取率的计算
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 萃取分离结果比较
• 6.3.2 初始蛋白质浓度的影响
• 6.3.3 亲和反胶团的循环利用
• 6.4 小结
• 附图
• 第七章 总结与展望
• 7.1 全文结论
• 7.2 创新点
• 7.3 工作展望
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 致谢