家蚕吡哆醛激酶基因的表达分析

论文摘要

维生素B6（VitaminB6, VB6）为水溶性维生素,是一类吡啶化合物的总称,游离型有吡哆醛（Pyridoxal, PL）、吡哆醇（Pyridoxine, PN）和吡哆胺（Pyridoxamine,PM）,相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5’-phosphate, PLP）、磷酸毗哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate, PNP）和磷酸吡哆胺（Pyridoxamine-5’-phosphate, PMP）。其中PLP是VB6的主要辅酶形式,参与氨基酸代谢的各种反应。吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK）是VB6关键代谢酶,在二价金属阳离子和ATP存在下,催化游离形式VB6各自磷酸化反应,生成相应的磷酸酯型,并且与磷酸吡哆醇氧化酶、磷酸酶一起维持细胞内PLP浓度的动态平衡。我们的前期研究采用生物信息学原理和PCR方法,构建家蚕PLK融合基因表达质粒pET22b-His-PLK,原核表达纯化出重组蛋白,并且分析了家蚕PLK的基本酶学性质,对其蛋白结构也进行了预测。本研究在此基础上将融合质粒在大肠杆菌中诱导表达,经亲和层析纯化,以纯化的蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价可达到1：51200以上。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白,用于Western blot实验。实验结果表明,PLK在家蚕的精巢、马氏管、中肠、表皮、头部等组织中都有表达,且表达量依次降低,而在丝腺中没有明显检测到该蛋白的存在。我们还利用荧光定量PCR的方法,对家蚕五龄幼虫各组织中的mRNA的量进行了比较。通过从：mRNA水平和蛋白质水平研究PLK基因在家蚕不同发育时期及幼虫不同组织中的转录、表达情况,明确了PLK在家蚕5龄期不同组织中的功能,为进一步探讨PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能提供重要依据。家蚕既是用于蚕丝生产的重要经济作物,也是仅次于果蝇作为昆虫研究的模式生物,同时还是开发新一代生物反应器和新型昆虫产业的材料。家蚕在生长发育和合成丝蛋白时,体内氨基酸的合成与代谢非常活跃,其中VB6代谢是一个重要环节。PLK在家蚕体内VB6的转换代谢中可能是一个关键控制点。研究PLK在家蚕体内的表达情况,有助于明确PLK的催化机制和表达调控机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 6及其在生物体内的作用'>1.1 维生素B₆及其在生物体内的作用
• 6的合成途径'>1.2 生物体中VB₆的合成途径
• 1.3 PLK基因结构研究进展
• 1.4 PLK晶体结构研究进展
• 6研究进展'>1.5 家蚕VB₆研究进展
• 1.6 荧光定量PCR技术
• 1.7 western blot技术
• 第2章 引言
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究内容
• 2.2.1. PLK在家蚕五龄幼虫各组织中转录水平的研究
• 2.2.2. PLK在家蚕不同发育时期及五龄幼虫中表达水平的研究
• 2.3 技术路线
• 2.4 课题来源
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 实验中常用试剂配方
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 总RNA的提取和检测
• 3.3.2 RNA反转录为cDNA
• 3.3.3 荧光定量PCR引物的设计
• 3.3.4 PLK在家蚕中转录水平的研究
• 3.3.5 融合蛋白的表达与纯化
• 3.3.6 多克隆抗体的制备
• 3.3.7 抗体的效价测定
• 3.3.8 Western blot检测抗体特异性
• 3.3.9 家蚕总蛋白的提取及定量
• 3.3.10 PLK在家蚕中表达水平的研究
• 第4章 结果与分析
• 4.1 RNA的提取和检测
• 4.1.1 RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 4.1.2 紫外分光光度法检测RNA纯度
• 4.2 cDNA第一链的浓度测定
• 4.3 PLK在家蚕中转录水平的研究
• 4.3.1 PCR反应条件的优化
• 4.3.2 五龄幼虫各组织RT产物的荧光定量PCR分析
• 4.4 重组蛋白的纯化
• 4.5 兔多克隆抗体的特异性鉴定
• 4.6 家蚕组织总蛋白粗提液的制备
• 4.7 PLK在家蚕组织中表达水平的研究
• 4.7.1 五龄幼虫各组织中PLK表达量的比较
• 4.7.2 五龄期表皮及马氏管组织中的PLK检测
• 4.7.3 家蚕发育过程中PLK表达量的变化
• 第5章 讨论
• 5.1 Trizol法提取RNA
• 5.2 荧光定量PCR数据处理方法
• 5.3 重组蛋白的纯化方式
• 5.4 Western blotting检测
• 5.5 PLK转录与表达水平个别组织差异形成的可能原因
• 5.6 PLK基因在家蚕中的表达分析
• 第6章 结论
• 6.1 家蚕PLK的原核表达
• 6.2 多克隆抗体的制备
• 6.3 家蚕PLK转录水平研究
• 6.4 家蚕PLK表达水平研究
• 参考文献
• 附录A 中英文缩写与注释
• 致谢
• 作者简介
• 成果清单