高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和N蛋白单克隆抗体的制备及新型亚单位疫苗研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。该病于1987年首次报道于美国,现已遍布全世界,给各国的养猪业造成了巨大的危害。而近几年在我国出现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的暴发与流行,给我国养猪业几乎造成了毁灭性的打击。由ORF5基因编码的GP5是PRRSV最主要的免疫原性蛋白,能诱发机体产生中和抗体,但由于诱骗表位A对中和表位B的覆盖效应,现有的基于天然ORF5基因构建的多种疫苗均难以产生较早和较高的中和抗体,但对ORF5基因进行适当的修饰,可以增强GP5的免疫原性。由ORF7编码的N蛋白是PRRSV高度保守的结构蛋白,也具有极强的免疫原性。PRRSV感染猪后,最早产生的就是针对N蛋白的抗体,且持续时间极长,因此N蛋白是目前公认最适合作PRRS诊断用的靶标。近年来,植物病毒及其编码的蛋白作为新型动物疫苗的载体受到格外的关注。许多植物病毒的衣壳蛋白可以在体外自我组装成病毒样颗粒（VLPs）,将外源肽展示在病毒粒子表面后具有很好的免疫原性,能够诱导机体产生特异性抗体,可以作为新型疫苗研究的重要平台。本研究针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,开展了GP5蛋白和N蛋白单克隆抗体的制备,同时,以植物病毒衣壳蛋白为载体,探讨了PRRS新型亚单位疫苗。主要研究内容包括：1.抗GP5单克隆抗体的制备以PRRSV WUH3株基因组RNA为摸板,RT-PCR扩增获得截去信号肽的ORF5基因cDNA片段,片段大小约为540bp。BamHI和Xhol酶切后克隆到载体pGEX-KG构建原核表达质粒pKG-ORF5。在大肠杆菌中表达后提取包涵体免疫小鼠,制备单抗。经ELISA筛选和Western blot验证,最终得到三株单抗,分别为2G8、3G8、1F12。三株单克隆抗体的小鼠腹水效价均达到100×28。2.抗N蛋白单克隆抗体的制备用BamHI和HindIII分别双酶切pET-30a和pGEX-KG-ORF7,回收连接,构建重组表达质粒pET-30a-ORF7。原核表达后纯化蛋白免疫小鼠,制备单抗,经ELISA筛选获得8株杂交瘤细胞,分别为：1A2、1D9、1F6、2C7、3B9、3H2、4D2和4E2。其中除1D9和4E2外,其余6株用真核表达的N蛋白作抗原经Western验证结果均为阳性。小鼠腹水效价均为100×29。3.番木瓜花叶病毒衣壳蛋白介导的PRRSV亚单位疫苗研究针对高致病性PRRSV WUH3株ORF5基因的特征,选取去除了信号肽但包含有中和表位B和覆盖表位A的GP5 N端第26-66aa片段,将辅助性T淋巴细胞表位（PADRE）的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆盖表位之间,将中和表位两端的糖基化位点（N30、N34、N35和N51）消除,同时用中和表位替换覆盖表位,并对ORF5基因密码子进行优化,以期达到充分暴露中和抗体表位,诱发机体更强免疫应答的目的。通过linker将其与番木瓜花叶病毒衣壳蛋白（PapMV CP）的C端相连,人工合成目的基因克隆到pET-30a,在大肠杆菌中融合表达。纯化的蛋白超离浓缩后在电镜下观察可见病毒样颗粒。以纯化的蛋白加佐剂乳化后免疫小鼠,两次免疫后未能检测到PRRSV特异性中和抗体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征
• 1.2 PRRSV流行病学特点
• 1.3 PRRSV病原学特性
• 1.3.1 PRRSV的分类及理化性质
• 1.3.2 PRRSV的抗原性
• 1.3.3 PRRSV的致病机理
• 1.3.4 PRRSV的生物学特性
• 1.4 PRRSV分子生物学研究进展
• 1.4.1 基因组结构及功能
• 1.4.2 PRRSV的蛋白质
• 1.5 PRRSV的免疫学反应
• 1.5.1 细胞免疫
• 1.5.2 体液免疫
• 1.5.3 天然免疫
• 1.5.4 抗体依赖性增强作用（ADE）
• 1.6 PRRS疫苗研究进展
• 1.6.1 传统疫苗
• 1.6.2 新型疫苗研究进展
• 1.7 植物病毒样颗粒载体系统
• 1.7.1 病毒样颗粒的特性
• 1.7.2 植物病毒样颗粒PapMV VLPs
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 毒株、细胞与菌株
• 3.1.3 载体与质粒
• 3.1.4 工具酶及主要试剂
• 3.1.5 培养基和抗生素的配制
• 3.1.6 主要缓冲液和相关试剂的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.4 外源DNA片段与克隆质粒载体的连接反应
• 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.6 连接产物的转化
• 3.2.7 质粒的制备与鉴定
• 3.2.8 诱导表达
• 3.2.9 蛋白的分离纯化
• 3.2.10 ELISA检测方法的建立
• 3.2.11 表达产物的Western blot检测
• 3.2.12 病毒样颗粒的电镜观察
• 50的测定'>3.2.13 半数细胞培养物感染量(TCID₅₀的测定
• 3.2.14 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
• 3.2.15 单克隆抗体的制备
• 3.2.16 分子生物学分析软件
• 第4章 结果与分析
• 4.1 抗GP5的单克隆抗体的制备
• 4.1.1 PRRSV WUH3株ORF5基因cDNA的扩增与克隆
• 4.1.2 原核表达质粒的构建与鉴定
• 4.1.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
• 4.1.4 单克隆抗体的制备
• 4.1.5 Western blot验证
• 4.1.6 单克隆抗体效价测定
• 4.2 抗N蛋白的单克隆抗体的制备
• 4.2.1 原核表达质粒的构建与鉴定
• 4.2.2 融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
• 4.2.3 单克隆抗体的制备
• 4.2.4 Western blot验证
• 4.2.5 单克隆抗体效价测定
• 4.2.6 单克隆抗体亚类鉴定
• 4.3 新型亚单位疫苗的研究
• 4.3.1 GP5中和表位的修饰
• 4.3.2 原核表达质粒的构建与鉴定
• 4.3.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
• 4.3.4 Western blot检测目的蛋白的体外表达
• 4.3.5 病毒样颗粒（VLPs）的电镜观察结果
• 4.3.6 免疫小鼠的中和抗体水平检测
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 抗GP5的单克隆抗体制备
• 5.1.2 抗N蛋白的单克隆抗体制备
• 5.1.3 新型亚单位疫苗的研究
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢