生物法制备（2R,3S）-苯基环氧丙酸乙酯的研究

论文摘要

(2R,3S)-苯基环氧丙酸乙酯含有一个环氧三元环结构,是合成抗癌药物紫杉醇侧链的关键中间体。本课题拟用微生物环氧化物水解酶制备（2R,3S）-苯基环氧丙酸乙酯。首先,以消旋的苯基缩水甘油为唯一碳源,从土壤中分离出200多株细菌和霉菌。其中30多株菌株能选择性水解拆分消旋苯基环氧肉桂酸乙酯。我们选取可选择性水解（2S,3R）构型,保留（2R,3S）构型,并具有最高立体选择性的霉菌作为进一步研究的对象。经过形态学观察,生理生化反应的鉴定和ITS基因序列分析,最终确定该菌为白地霉,并命名为 Galactomyces geotrichum ZJUTZQ 200。接着,利用单因素实验对菌株G.geotrichum ZJUTZQ 200的产酶条件进行优化,考察了碳源、氮源、金属离子、初始pH、发酵时间、接种量对菌株立体选择性、活性、生物量的影响。并进行4因素4水平的正交实验,最终确定了该菌株的最佳发酵条件是:甘油1%,黄豆粉1.5%,硝酸钠0.3%,无水硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,pH 5.0。在此条件下该菌株培养48h,温度30℃,摇床转速200rpm,e.e.s值从开始的85.5%提高到93.2%,转化率由78.3%,提高到87.6%,生物量从最初的8.2 g/L提高到34.3 g/L,提高了近四倍。其后,利用单因素实验对G.geotrichum ZJUTZQ 200水解动力学拆分苯基环氧丙酸乙酯进行优化,考察了温度、表面活性剂、助溶剂、两相体系、转化时间及酶与底物比对该菌立体选择性的影响,最终确定最佳转化条件为:温度30℃,pH7.0,DMSO为助溶剂,底物/酶5%,转化 8h。此时,e.e.s>99.9%,E=49。最后,本论文将反应体系放大到200 mL,8 h之内,成功制得（2R,3S）-苯基环氧丙酸乙酯0.51 g。并以（2R,3S）-苯基环氧丙酸乙酯为原料,最终成功制的0.102 g有旋光性质的紫杉醇侧链（2R,3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯。此外,本论文研究了该菌对底物类似物的立体选择性,发现该菌对苯基缩水甘油酸脂类化合物均有较好的选择性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 手性环氧丙酸脂类化合物的重要性
• 1.1.1 手性环氧酸酯类化合物
• 1.1.2 手性环氧酸酯类化合物的应用
• 1.2 手性苯基环氧丙酸脂类化合物的合成方法
• 1.3 环氧化物水解酶的研究进展
• 1.3.1 环氧化物水解酶简介
• 1.3.2 环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中的应用
• 1.4 课题研究背景、内容及意义
• 第二章 环氧化物水解酶产生菌的筛选及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 配制试剂
• 2.1.5 检测方法
• 2.1.6 EPG特性的初步研究
• 2.1.7 菌种筛选及分离
• 2.1.8 数据分析
• 2.1.9 菌种鉴定
• 2.1.10 2,3-二羟基苯基内酸乙酯的合成
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 EPG标准曲线的测定
• 2.2.2 EPG自发水解率的测定
• 2.2.3 菌株筛选
• 2.2.4 菌种鉴定
• 2.2.5 2.3-二羟基苯基丙酸乙酯的合成
• 2.3 本章小结
• 第三章 G.geotrichum ZJUTZQ 200产酶条件的研究
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 碳源的优化
• 3.2.2 氮源的优化
• 3.2.3 金属离子的优化
• 3.2.4 培养基初始pH的优化
• 3.2.5 底物诱导对菌体生长及酶对映选择性的影响
• 3.2.6 发酵时间对菌体生长及酶对映选择性的影响
• 3.2.7 接种量对菌体生长及酶对映选择性的影响
• 3.2.8 正交实验结果
• 3.3 本章小结
• 第四章 G.geotrichum ZJUTZQ 200对底物EPG拆分条件的研究
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 转化时间对底物拆分的影响
• 4.2.2 转化温度对底物拆分的影响
• 4.2.3 Tween 80对底物拆分的影响
• 4.2.4 pH对底物拆分的影响
• 4.2.5 助溶剂对底物拆分的影响
• 4.2.6 两相体系对底物拆分的影响
• 4.2.7 底物与酶质量比对底物拆分的影响
• 4.3 本章小结
• 第五章 底物谱的研究及紫杉醇侧链（2R,3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯的合成
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 G.geotrichum ZJUTZQ 200对九种底物的拆分结果
• 5.2.2 G.geotrichum ZJUTZQ 200上罐发酵培养
• 5.2.3 G.geotrichum ZJUTZQ 200放大转化体系的研究
• 5.2.4 紫杉醇侧链（2R,3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯合成
• 5.3 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文