自噬在双联苄化合物逆转耐药及紫杉醇化疗中的作用

论文摘要

肿瘤是一种常见病、多发病,其中恶性肿瘤已成为威胁人类健康的重要原因,其发病率及死亡率均居各类疾病之首。化疗在肿瘤的综合治疗中一直发挥着重要作用,但由于化疗药物的连续、大量使用,已经导致不同程度肿瘤耐药性的产生。肿瘤耐药常常以多药耐药multidrug resistance,MDR)为主要形式,多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药的同时,对另一些未曾接触、与之化学结构、作用机理完全不同的抗肿瘤药物也产生耐药,是一种广谱的耐药现象。MDR已成为恶性肿瘤化疗过程中的一个棘手问题,也是肿瘤化疗失败及生存预后差的主要原因,研究耐药产生的相关机制、寻找有效的逆转剂一直备受关注。肿瘤耐药的机制十分复杂,涉及到多种不同途径,其中P-glycoprotein （P-gp）在耐药的形成中占有重要地位,被认为是经典的耐药机制。P-gp作为ATP依赖的跨膜蛋白,通过ATP水解释放能量将与之结合的药物从细胞内转移到细胞外,使细胞内药物浓度下降,从而引起肿瘤细胞的多药耐药。P-gp对天然的疏水性化疗药物有较强的外泵作用。随着MDR发生机制研究的深入,用不同手段和方法来克服P-gp介导的MDR已在实验和临床应用方面有了很大进展。其中比较有效的方法是增加细胞内化疗药物浓度来逆转MDR,已发现的P-gp逆转剂包括：钙拮抗剂、免疫调节剂、中药逆转剂等。虽然这些逆转剂在体外有明显的逆转作用,但是在体内大多会产生明显的毒副作用,所以,目前还没有理想的MDR逆转剂上市。近年来,人们将目光转向天然药物,期望从天然资源中寻求到安全、有效、低毒的耐药逆转剂。双联苄（Bisbibenzyl）是苔藓植物中特有的一类天然多酚类化合物,具有抗真菌、抗微生物、抗氧化、细胞毒性和抗血小板凝集等广泛而又显著的生物学活性。迄今为止,已从苔藓植物中发现100余种结构类型新颖、活性多样的双联苄类化合物。本课题组对100余种双联苄类化合物进行筛选,发现此类化合物确有不同程度的抗肿瘤活性,并对典型化合物进行初步的机制分析和动物实验。其中双联苄类化合物地钱素C （marchantin C）、dihydroptychantol A（DHA）不仅具有良好的抗肿瘤活性,抑制A172、K562、HepG2、MX-1和Hela等肿瘤细胞的生长,而且具有一定的逆转耐药活性。因此,本课题组对地钱素C和DHA进行了化学全合成,同时制备了地钱素C的衍生物MC1、MC2、和MC3,以及DHA的衍生物DHA1,DHA2,DHA3,以期探讨它们逆转MDR的生物学活性、机制及可能的构效关系,为进一步的深入研究奠定基础。研究结果显示,这两种化合物均有一定的逆转耐药活性,且以P-gp为靶点发挥作用。其中地钱素C的衍生物MC2和DHA的衍生物DHA2的细胞毒性小、且逆转活性较高。进一步探讨其逆转耐药机制时发现,细胞自噬参与了DHA2逆转多药耐药的过程,同时,自噬也参与临床常用抗肿瘤药物紫杉醇的抗肿瘤过程。因此,我们对自噬在药物逆转MDR、抗肿瘤过程中的作用进行了探讨。第一部分地钱素C及其衍生物的多药耐药逆转作用及机制实验目的：观察地钱素C及其衍生物的多药耐药逆转活性,研究地钱素C及其衍生物逆转多药耐药的机制。实验方法：1.通过MTT检测地钱素C及其衍生物的细胞毒性和它们的多药耐药逆转作用。2.通过Western-Blot检测P-gp蛋白的表达,从而阐明地钱素C的衍生物MC2对P-gp蛋白表达的影响。3.通过罗丹明蓄积和外排实验,明确MC2对P-gp蛋白功能的影响。4.采用DAPI染色检测细胞凋亡,Western-Blot检测Bcl-2,Bax,PARP蛋白的表达变化,阐明MC2和VCR联合用药对多药耐药细胞凋亡的影响。实验结果：1.地钱素C及其衍生物MC1,MC2,MC3都具有一定的多药耐药逆转作用,其中MC2的逆转效果最好,并且MC2的细胞毒性最低。2.MC2能够引起ADR和罗丹明在多药耐药细胞KB/VCR中的明显蓄积,并且可以减少罗丹明的外排,MC2对P-gp蛋白的表达没有影响,说明MC2可以通过抑制P-gp蛋白的功能来逆转多药耐药。3.当MC2和长春新碱（Vincristine,VCR）联合用药时,具有协同效应,可显著增强VCR对多药耐药细胞KB/VCR的诱导凋亡作用。结论：地钱素C及其衍生物均有明显的多药耐药逆转作用。其中MC2的逆转耐药活性明显优于其母核化合物地钱素C,其作用是通过抑制P-gp蛋白的功能而实现的。MC2和VCR联用时可以明显的提高VCR的化疗效果,因此,MC2有望成为新的多药耐药逆转剂。第二部分抑制自噬提高DHA2的逆转耐药作用实验目的：观察DHA的衍生物的多药耐药逆转活性,研究自噬在DHA的衍生物DHA2逆转耐药中的作用。实验方法：1.通过MTT检测DHA1,DHA2和DHA3的细胞毒性和它们的多药耐药逆转作用。2.通过Western-blot检测P-gp蛋白的表达,阐明DHA2对P-gp蛋白表达的影响。3.通过阿霉素和罗丹明123的蓄积实验,检测DHA2对P-gp蛋白功能的影响。4.通过Western-Blot检测LC3Ⅱ表达的变化,电镜观察细胞内的自噬泡,免疫荧光观察细胞内LC3蛋白的聚集,证实DHA2引起的细胞自噬现象。5.ATP检测试剂盒检测细胞内的ATP水平。6.经3-MA抑制DHA2诱导的细胞自噬后,检测DHA2逆转耐药的效果；通过belin 1 siRNA降低Beclin 1蛋白的表达,抑制DHA2诱导的细胞自噬后,观察DHA2逆转耐药的效果,从而阐明DHA2诱导的自噬和它的多药耐药逆转活性之间的关系。实验结果：1.DHA的衍生物DHA1,DHA2和DHA3都有逆转耐药的效果,其中DHA2的逆转耐药活性较为突出。2.DHA2不影响P-gp的表达,但能明显促进阿霉素和罗丹明123在多药耐药细胞内的蓄积,说明DHA2可抑制P-gp蛋白的功能。3.DHA2使LC3的表达明显增高,使更多的LC3Ⅰ转变成了LC3Ⅱ,并且使LC3Ⅱ在细胞内聚集,光镜及电镜观察显示DHA2引起肿瘤细胞内的自噬泡明显增多,这些结果表明DHA2可以诱导肿瘤细胞产生自噬。4.经自噬抑制剂3-MA抑制自噬以后,可显著增加DHA2的逆转耐药作用,而经beclin 1 siRNA降低与自噬起始有关的基因Beclin 1的表达、抑制自噬形成后,DHA2的逆转耐药效果同样明显增强。因此,自噬在DHA2的逆转耐药过程中对肿瘤细胞起到了一定的保护作用。5.3-MA和beclin 1 siRNA抑制自噬形成以后,可以抑制细胞在应激状态下的能量循环,使细胞内ATP的含量更加明显的降低。结论：DHA1,DHA2和DHA3都具有一定的逆转耐药活性,且DHA2通过抑制P-gp蛋白的功能而发挥其逆转多药耐药作用。DHA2可以诱导多药耐药细胞产生自噬,通过自噬抑制剂3-MA和beclin 1 siRNA降低自噬水平以后,DHA2逆转耐药的效果明显增强,说明自噬在DHA逆转多药耐药过程中对肿瘤细胞起到了一定的保护作用。第三部分抑制自噬提高紫杉醇诱导的细胞凋亡实验目的：上述结果表明,联苄化合物可诱导自噬性保护机制参与其逆转耐药活性,是否细胞自噬也参与临床化疗药物的抗肿瘤过程。我们以临床广谱化疗药物紫杉醇作为典型药物,研究自噬作用是否也与其抗肿瘤活性有关。实验方法：1. DAPI染色检测紫杉醇诱导的细胞凋亡; Western-Blot检测Bcl-2, Bax和PARP表达的变化。2. Western-Blot检测自噬相关蛋白LC3, Beclinl和Atg5表达的变化；荧光显微镜观察瞬时转染GFP-LC3质粒的A549细胞中自噬体的形成；AO染色观察紫杉醇作用于A549细胞后,酸性囊泡的形成,从而确定紫杉醇的诱导自噬作用。3.自噬抑制剂3-MA抑制紫杉醇诱导的细胞自噬,分析抑制自噬后对紫杉醇细胞毒性的影响,通过AnnexinV/PI染色,观察细胞凋亡4.通过Beclin 1 siRNA降低Beclin 1蛋白的表达,抑制紫杉醇诱导的细胞自噬,进一步观察自噬对紫杉醇细胞毒性的影响。5.A549细胞接种裸鼠,分别用PBS,3-MA,紫杉醇,紫杉醇+3-MA进行治疗,观察紫杉醇在体内是否能够诱导肿瘤细胞产生自噬及自噬在紫杉醇化疗中的作用。6.荧光显微镜观察稳定转染GFP-LC3的U87细胞和瞬时转染GFP-LC3的PC3和HT-29细胞中自噬泡的形成。Western-Blot检测紫杉醇作用后LC3, Beclin 1,和Atg5表达的变化。用3-MA抑制紫杉醇诱导的细胞自噬,观察紫杉醇对U87, PC3和HT-29细胞的细胞毒性的变化。实验结果：1.紫杉醇能够明显诱导A549细胞凋亡2.紫杉醇作用于A549细胞后,LC3的表达明显增高,有更多的LC3Ⅰ剪切成LC3Ⅱ,自噬相关蛋白Beclin 1和Atg5的表达明显升高；GFP-LC3蛋白在细胞内聚集；A549细胞内酸性囊泡明显增多。这些结果表明,紫杉醇作用A549细胞后,可以诱导细胞产生自噬。3.用3-MA抑制自噬后,紫杉醇对A549细胞的细胞毒性明显增强,能够诱导更多的细胞凋亡。Beclin 1 siRNA降低Beclinl蛋白的表达,抑制自噬形成后,紫杉醇的细胞毒活性明显增强,凋亡细胞增多。4.裸鼠动物实验结果显示,紫杉醇可诱导肿瘤组织产生自噬,并且3-MA抑制自噬以后,可以提高紫杉醇的化疗效果。5.紫杉醇不仅能够诱导A549细胞产生自噬,紫杉醇也可以诱导其它肿瘤细胞产生自噬,如U87,PC3和HT-29细胞,表明紫杉醇诱导的自噬现象可能具有普遍性。实验结论：紫杉醇在诱导肿瘤细胞凋亡的同时可以诱导肿瘤细胞产生自噬。抑制自噬可以提高肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性,说明自噬对肿瘤细胞起到了一定保护作用。在临床化疗中可以通过与自噬抑制剂联用,提高紫杉醇的化疗效果。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一部分 地钱素C及其衍生物的多药耐药逆转作用及机制
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 抑制自噬提高DHA2的逆转耐药作用
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 抑制自噬提高紫杉醇诱导的细胞凋亡
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
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