论文摘要
内毒素（lipopolysaccharide,LPS）激活单核/巨噬细胞引起的细胞因子过度释放是临床上全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）或脓毒症的主要触发因素。SIRS或脓毒症具有较高的发病率与死亡率,而临床上目前尚无有效的防治措施,所以针对该问题的防治性研究一直是临床医学关注的热点。脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein,LBP）对LPS的毒性作用具有催化放大效应,含有特异性LPS结合位点的多肽可以通过阻断LBP-LPS相互作用来拮抗LPS的毒性作用,是抗内毒素作用的有效手段。LPS分子具有富含负电荷磷酸基团及疏水性长链脂肪酸的特征,容易结合带正电荷及疏水性较强的分子。国外多项研究报道,LBP、BPI及LALF等天然内毒素结合蛋白的衍生肽均具有高正电荷数及疏水性,可以通过阻断LPS与LBP的结合来抑制LPS诱发的体内外炎性反应。目前已经明确,LBP109-133氨基酸区域是LBP与内毒素结合的主要区域,对应于此区域的多肽（命名为EBP）经本室以前的研究证实具有中和内毒素活性。在此基础上,为了进一步提高其生物活性,作者借助于DNAsis软件,设计了具有更强正电荷及疏水性的突变体mEBP,使其更易于结合LPS;并对EBP及mEBP进行克隆表达以研究其抗内毒素活性。实验中将EBP一级结构中的酸性及中性氨基酸用赖氨酸替换后,应用DNAsis软件计算预突变体的等电点与疏水性,筛选具有高正电荷数及疏水性的突变体-mEBP;通过基因定点诱变技术获得mEBP对应的基因片断,构建PinpointXa3-mEBP表达质粒,转化DH5α菌,在此基础上筛选目的基因高表达株,IPTG诱导表达;对以包涵体形式表达的两种蛋白进行分离并亲和层析纯化;经凝血酶Xa切割获得2种目的肽EBP及mEBP,两步纯化后对mEBP进行氨基末端10个氨基酸序列测定;最后应用新鲜人外周血分离的单个核细胞及烧伤复合内毒素血症小鼠进行体内外抗内毒素活性检测,对比研究EBP及mEBP的生物学功能。主要研究结果及结论如下:1.EBP基因第13,54位C替换为A,对应肽的5,18位谷氨酰胺替换为赖氨酸后,DNAsis分析等电点由突变前的12.24变为12.26,所带正电荷数由+6增至+8,平均疏水性由0.13增为0.33,确定为预突变体。2.以含EBP基因的质粒为模板进行PCR定点突变,获得突变体mEBP基因,将其克隆入原核融合表达载体PinpointXa-3,经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒。3.氯化钙法将表达载体转化大肠杆菌DH5a,筛选转化克隆,以0.2mmol/L IPTG诱导2种融合蛋白表达5小时,优化表达条件,结果目的蛋白以包涵体形式获得高表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定结果显示在16.5kD位置有特异性蛋白条带。4.分离溶解包涵体获得融合蛋白,用抗生物素树脂SofilinkTM Release Avidin Resin亲和层析纯化,得到浓度大于85%的融合蛋白。因子Xa切割融合蛋白使目的肽与融合伴侣分开,亲和层析纯化及反相高压液相色谱纯化,分别获得98%以上纯度的EBP与mEBP。5.对比研究EBP与mEBP的体内外生物活性:（1）mEBP较等浓度EBP具有更好的结合内毒素能力。（2）12.5μg/ml的EBP及2、5、12.5ug/ml的mEBP均有明显抑制单核细胞分泌IL-6及TNF-α的作用（IL-6:P＜0.01;TNF-α:P＜0.01）;5gg/ml的EBP仅有抑制IL-6释放的作用,而12.5ug/ml的mEBP作用后细胞因子浓度（IL-6:37.3+5.3,TNF-α:53.3±0.9）与阳性对照PMB作用后无明显差异（IL-6:43.6±6.9,TNF-α:49.7±5.5）（P＞0.05）。（3）在模型小鼠体内,5mg/kg及10mg/kg浓度的mEBP或EBP均有显著抑制细胞因子释放的效应,其中5mg/kg mEBP处理组小鼠体内细胞因子浓度（IL-6:168±26,TNF-α:295±38）显著低于等浓度EBP处理组（IL-6:301±42,TNF-α:541±43）（P＜0.05）。RT-PCR半定量分析结果还显示,10mg/kgmEBP具有较强抑制小鼠肝组织内TNF-amRNA表达的作用。对小鼠存活率影响方面,5mg/kg及10mg/kg mEBP处理后,与模型组相比,小鼠存活率分别上升了20%及40%,而EBP处理组对小鼠存活率没有影响。肝、肺、肾的病理组织学改变可见:10mg/kg mEBP处理组脏器损害程度较轻。本研究结果提示:含有内毒素结合位点的小分子LBP衍生肽通过结合LPS来发挥拮抗内毒素活性,而理化性质的改变对其生物活性产生重要的影响。
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