NAC和雷帕霉素通过抑制镉诱导神经元氧化应激和mTOR通路激活抗凋亡机理研究

论文摘要

本文通过体外分离培养原代小鼠皮质神经元,运用细胞培养、Western blotting等技术从细胞分子生物学角度,分析N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和雷帕霉素（Rap）干预镉诱导神经元ROS和mTOR通路激活抗凋亡的机制；通过慢性镉染毒实验小鼠模型,运用HE染色、透射电镜和免疫组织化学染色等分析方法,探究了镉诱发大脑组织和细胞损伤过程中,NAC对其变化效应,综合分析了NAC拮抗镉诱导神经元介导mTOR通路激活发挥抗凋亡的机理。结果如下：1 NAC和Rap通过抑制镉诱导神经元ROS和]mTOR通路激活抗凋亡以原代小鼠皮质神经元为对象,将分离的原代神经元细胞悬液接种在96（1×104/孔）或6（5×105/孔或2×106/孔）孔板中培养6天后的大脑皮质神经元分别用0-120μM CdCl2处理24 h,或用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC,5 mM）和雷帕霉素（Rap,0.2μg/ml）预处理1h和48h后用10和20μM CdCl2暴露4h或24h。采用MTT法分析细胞活性,用荧光探针CM-H2DCFDA分析细胞ROS荧光强度。Western blot测定mTOR通路相关信号蛋白变化。我们观察到镉以浓度依赖的方式诱导神经元凋亡,这与镉诱导ROS产生和Akt/mTOR通路激活有密切关系。用ROS清除剂NAC预处理或mTOR靶向特异抑制剂Rap预处理,可以通过阻滞ROS产生和mTOR通路激活,明显削弱镉诱导的神经元凋亡。提示：NAC和Rap通过抑制镉诱导神经元ROS和mTOR通路激活抗凋亡。2 NAC对慢性镉染毒实验小鼠大脑组织和细胞损伤的保护作用研究选用健康成年ICR小鼠64只,分为对照组（0.9%生理盐水）和镉处理10、25或50 mg/L CdCl2处理组诱发小鼠大脑组织和细胞损伤,及NAC组,NAC加10、25或50 mg/L CdCl2处理组观察保护情况,共8组。镉采用自由饮水方式,NAC溶于生理盐水（15mg/ml）按150mg/kg体重,每隔1天腹腔注射,连续4周。采用常规HE染色观察组织学变化和透射电镜TEM观察细胞超微结构变化,以及免疫组化分析4E-BP1磷酸化表现。结果表明：在光学显微镜下,大脑皮层和海马区组织结构的变化,大脑颞叶皮层三层结构（CP1-3）出现明显的混乱等现象,而且底板区（SP）模糊、心室层（VZ）减少和底板（SP）到中间层（IZ）细胞松动现象,细胞异常集中在中间带,且以镉浓度依赖的方式呈现大脑颞叶皮层结构不清,部分神经细胞核固缩,出现筛网状结构；海马区CA1-CA2区细胞异位,呈空泡样变性,海马齿状回明显松散,细胞间出现间隙。而NAC和Cd联合处理组的小鼠在皮层组织学结构上可以看到NAC明显的保护作用,小鼠大脑皮层三层结构明显。海马结构齿状回颗粒细胞密集,排列均匀,CA1-CA2区明显。透射电镜观察皮层神经细胞内胞体缩小,神经元细胞内细胞器结构紊乱,线粒体肿胀。免疫组化结果证明mTOR信号通路的下游蛋白p-4EBP1以浓度依赖的方式在海马CA1区表达,大脑皮层犹以底板层的Ⅰ-Ⅲ层更为密集,海马区阳性细胞沿海马齿状回颗粒细胞层呈线状排列,细胞呈圆形,均匀深染,NAC对小鼠大脑皮层额叶分子层的Ⅰ-Ⅲ层和海马CA1区4E-BP1磷酸化有明显的保护作用。提示：NAC干预了慢性镉染毒实验小鼠大脑皮层和海马区组织结构变化和mTOR通路激活。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 镉对神经系统毒性作用及其机理研究进展
• 1 镉在环境中的分布及危害
• 2 镉对神经系统毒性作用
• 3 镉诱导神经系统毒性作用机理
• 3.1 镉诱导氧化应激致神经细胞凋亡
• 3.2 镉通过线粒体损伤导致神经细胞凋亡
• 3.3 镉激活多信号通路致神经细胞凋亡
• 4 镉诱导的神经变性疾病
• 参考文献
• 第二章 mTOR信号通路在神经系统中的重要作用
• 1 mTOR结构及其上下游效应分子
• 1.1 mTOR结构
• 1.2 mTOR的上游调节分子Rheb和TSC1/2
• 1.3 mTOR的下游效应分子4EBP1和S6K1
• 2 mTOR信号通路及其作用
• 2.1 mTOR信号通路作用
• 2.2 mTOR在神经细胞生长、发育中的作用
• 2.3 mTOR在神经细胞的凋亡和自噬中的作用
• 2.4 mTOR与神经退行性疾病关系
• 2.4.1 mTOR与阿尔茨海默病关系
• 2.4.2 mTOR与帕金森病关系
• 2.5 mTOR在神经元中作用的近期研究
• 参考文献
• 第三章 NAC抗氧化应激对机体的保护作用
• 1 氧化应激
• 1.1 氧自由基的生成与清除
• 1.2 氧化应激的作用机制
• 1.2.1 对脂质的损伤
• 1.2.2 对核酸的损伤
• 1.3 ROS与细胞内信号传导
• 1.3.1 ROS与体内多种代谢和信号通路
• 1.3.3 ROS对转录因子的作用
• 2 NAC抗氧化应激对机体的保护作用
• 2.1 NAC的化学性质
• 2.2 NAC对机体的保护作用
• 2.2.1 NAC与细胞凋亡
• 2.2.2 NAC与细胞自噬
• 2.2.4 NAC与DNA损伤
• 2.2.5 NAC与免疫调节作用
• 2.2.6 NAC与神经病变的关系
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第四章 NAC和Rap通过抑制镉诱导神经元ROS和mTOR通路激活抗凋亡研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 主要药品与试剂
• 1.2 实验动物
• 1.3 原代小鼠皮质神经元的分离和培养
• 1.4 MTT细胞活性分析
• 1.5 神经元凋亡形态学观察
• 1.6 神经元ROS分析
• 1.7 免疫印迹（Western blot）分析
• 1.8 数据处理
• 2 结果
• 2.1 镉诱导ROS产生导致神经元凋亡
• 2.2 NAC通过抑制镉诱导神经元ROS和mTOR通路激活抗凋亡
• 2.3 Rap通过抑制镉诱导神经元ROS和mTOR通路激活抗凋亡
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第五章 NAC对慢性镉染毒实验小鼠大脑组织和细胞损伤的保护作用研究
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 主要药品与试剂
• 1.2 实验动物
• 1.3 样品采集和处理
• 2 结果
• 2.1 NAC给予慢性镉染毒小鼠对大脑组织学结构的保护效应
• 2.2 NAC给予慢性镉染毒小鼠对大脑皮层细胞超微结构的保护效应
• 2.3 NAC抑制慢性镉染毒小鼠大脑皮层和海马组织细胞4E-BP1磷酸化表达
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文结论
• 致谢
• 附1