论文摘要
黄瓜枯萎病是一种真菌性土传病害,严重影响了黄瓜的产量和品质。其病原菌为半知菌亚门镰孢属的尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, FOC）。目前,黄瓜枯萎病致病机制的相关研究进展比较缓慢,争议最大的焦点是导管堵塞和毒素作用。导管堵塞学说认为病菌侵染后进入维管束,产生大量的菌丝和菌核,同时植物体会形成胼胝质、侵填体和胶质等,这些物质的形成会妨碍水分的运输,引起植株萎蔫。毒素作用理论认为病原菌毒素能够干扰植株的代谢活动,改变细胞膜透性,使水分直接从受伤害的细胞中扩散出去,破坏植株水分平衡,导致植株萎蔫。本研究通过探讨与黄瓜枯萎病发生相关的生理生化过程,以期从生理水平上阐述黄瓜枯萎病的致病机制,并为黄瓜枯萎病的防控提供理论基础。本研究采用土壤培养方式,研究了病原菌侵染对黄瓜植株水分、光合特性、毒素产生及作用方式等的影响,探讨了黄瓜枯萎病的发病生理机制。在发病机制的理论基础上,采用营养液培养,研究了不同形态氮素营养（铵态氮和硝态氮）对黄瓜枯萎病防控的影响,通过分析病原菌侵染对不同氮素形态下黄瓜植株体内水分关系、物质代谢过程、毒素的响应能力、分泌物组成及转录水平的影响,探讨了氮素营养的抗病机制。主要研究结果如下：1.病原菌侵染后黄瓜植株的蒸腾速率（E）、气孔导度（gs）、叶片含水量及叶片水势均显著降低;而E/gs显著上升,说明病原菌侵染促进了叶片非气孔水分散失。虽然病原菌侵染显著降低了导水率,但植株红墨水吸收结果表明,侵染植株叶片中红墨水的吸收量显著高于健康植株。此外,通过电镜观察侵染植株的叶片细胞膜,及分析叶片H+-ATPase酶活性及叶片电导率,发现侵染植株叶片细胞膜遭到严重破坏,说明尽管发病植株茎秆萎缩,但植株的水分吸收及运输仍能满足叶片的需求;病原菌的侵染导致叶片细胞膜受伤害,从而使水分直接以非气孔形式散失,叶片水分平衡遭到破坏,最终导致植株萎蔫。2.在侵染前期,病原菌的侵染导致叶片ABA含量升高、气孔关闭、叶片温度升高。叶片温度与蒸腾速率之间呈显著负相关关系。然而,植株叶片在光下和暗处呈现不同的响应：在光下,发病植株的叶片温度显著高于健康植株;在暗处,发病植株的叶片温度却显著低于健康植株,说明发病植株中叶片的水分散失不是通过气孔,而是从伤害细胞中扩散出去的。在侵染后期,侵染植株叶片水分平衡遭到严重破坏,叶片组织脱水坏死,从而导致植株叶片温度持续上升。上述结果说明,FOC的侵染能够导致叶片细胞膜伤害,使水分直接从受伤害的细胞中扩散出去,破坏叶片水分平衡,最终导致植株萎蔫。通过监测叶片在光下和暗处的温度响应,红外热像仪不仅可以直接非损伤的监测土传病害的发生过程,同时还能揭示植株体内与水分状况相关的生理过程。3.病原菌毒素（FA）处理后,叶片气孔关闭、叶片温度上升。在光暗交替环境中,FA处理植株在光下的叶片温度显著高于健康植株;在暗处,FA处理植株的叶片温度却显著低于健康植株。此外,FA处理后黄瓜植株叶片细胞膜遭到了严重的破坏。为验证FA处理后水分直接从受伤害的细胞中扩散出去,采用分根实验方法,对黄瓜植株的两侧根系分别供应0ppm和100ppm的FA。分根处理后,暗处叶片低温区域的FA含量及细胞伤害程度均显著高于高温区域。韧皮部烫伤对黄瓜植株FA的吸收以及分布无影响,FA主要通过木质部进行运输。由此可见,FA能够诱导植株叶片细胞膜伤害,使水分以非气孔途径散失,最终导致植株萎蔫。通过红外热像仪监测叶片在光下和暗处的温度变化,可以直接非损伤的监测病菌侵染时植株的萎蔫过程。4.与铵态氮相比,硝态氮营养显著降低了黄瓜植株枯萎病的发病率,并显著促进了植株的生长以及植株生物量的增加。铵态氮植株的光合速率、气孔导度、蒸腾速率、羧化效率及表观量子效率均显著高于硝态氮植株,然而铵态氮植株的叶片温度及水分吸收量均显著低于硝态氮植株。铵态氮植株中可溶性蛋白及可溶性糖含量均显著高于硝态氮植株,从而能够促进病原菌对铵态氮植株的侵染。FOC的侵染显著抑制了铵态氮植株的生长、叶片光合和水分吸收,干扰了植株体内的物质代谢,而病原菌的侵染却对硝态氮植株无显著影响。由此可见,硝态氮植株对黄瓜植株的生长更有益,能够更好的防控枯萎病的发生,因此在黄瓜的栽培中,应当适当增加硝态氮肥的施入而减少铵态氮肥的施用以抑制枯萎病的发生。5.FOC侵染后,硝态氮植株体内病原菌的数量显著低于铵态氮植株。与硝态氮相比,铵态氮植株的根系分泌物显著促进了病原菌孢子的萌发。经HPLC鉴定,黄瓜植株的根系分泌物主要含有草酸和柠檬酸两种有机酸,且铵态氮植株根系分泌物中柠檬酸含量显著高于硝态氮植株。FOC侵染显著促进了铵态氮植株根系分泌物中柠檬酸含量,而对硝态氮植株无影响。在柠檬酸浓度为5μ-50μM时,尖孢镰刀菌的孢子萌发率随柠檬酸浓度的增加而增加。此外,外源添加柠檬酸能显著增加黄瓜植株的病情植株及病原菌数量。由此可见,根系分泌物在硝态氮抗枯萎病的过程中发挥着重要作用;黄瓜植株在铵态氮营养下根系分泌物中柠檬酸含量增加,从而促进病原菌孢子的萌发,导致枯萎病发病率增加。6.FOC侵染后,在铵态氮植株和硝态氮植株体内均能监测到FA;铵态氮植株叶片和茎中的FA含量显著高于硝态氮植株,而根中的FA含量却与硝态氮植株无明显差异。FA处理后铵态氮植株迅速萎蔫,而硝态氮植株无明显萎蔫症状；FA对铵态氮植株叶片缅胞膜的伤害程度高于硝态氮植株。虽然铵态氮植株FA的吸收体积显著低于硝态氮植株,但铵态氮植株和硝态氮植株FA的吸收总量却无显著差异；硝态氮植株FA的平均吸收浓度显著低于铵态氮植株。FA处理后,硝态氮植株根系中FA的含量显著高于铵态氮植株,而叶片和茎中的FA含量却显著低于铵态氮植株。由此可见,FOC侵染后硝态氮植株中FA含量较少;硝态氮植株能够选择性的吸收FA,且吸收的FA主要积累在根中,限制FA向地上部的运输,减少对地上部的伤害；硝态氮植株对FA具有更强的耐毒性。7.通过对FOC侵染后不同形态氮素营养下黄瓜植株根系进行转录组水平分析,表明差异基因生物学过程主要富集在细胞过程、代谢过程、刺激响应和生物调控等中；细胞组分主要富集在细胞、细胞部分、细胞器和细胞膜等中；而分子功能主要富集在催化活性和结合中;差异基因所参与的KEGG通路主要富集在代谢途径、氮素代谢、植物-病原菌互作、次生代谢产物合成、苯丙素生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成、黄酮及黄酮醇生物合成这8种通路中。通过比较病原菌侵染后不同形态氮素营养下黄瓜植株根系中与抗病相关基因表达的差异,表明FOC侵染后,硝态氮植株根系中大部分调控CERK1、BAK1、FLS2、Rboh、RPM1、PBS1和LOX的相关基因的表达均显著上调,从而诱导硝态氮植株的防御反应,增强硝态氮植株抗病性。