编码微球微流控芯片检测禽流感病毒方法的建立

论文摘要

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类毁灭性疾病。高致病性禽流感被国际兽医局(OIE)定为A类传染病。该病自1878年首次报道以来，世界上许多国家和地区均有发生，AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。特别是禽流感病毒H5N1亚型于1997年、H9N2亚型于1999年、H7N7亚型于2003年和H5NI亚型于2004年先后发生感染人的事件，使得人们更加关注禽流感的公共卫生意义。高分子荧光微球是指直径在微米至纳米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量刺激能激发出荧光的固体颗粒。新近发展的高分子荧光微球是一种性能良好的蛋白质载体，具有粒度均一、稳定性好、可连接多种生物活性物质从而便于多参数分析等优点，因可吸附抗体而特异性地检测相应抗原故常用于免疫分析中的诊断试剂或试剂盒组件。而流式细胞术是一项集多种技术于一体的新型高科技细胞分析技术，是一种自动而迅速地进行细胞及免疫分析的标准方法。第二篇介绍了基于禽流感病毒多克隆抗体的制备及纯化，以聚苯乙烯微球作为蛋白质载体结合传统的ELISA技术、荧光抗体标记技术、流式细胞术等试验方法，建立禽流感病毒免疫检测体系，研究了检测禽流感病毒的流式细胞术新方法，同时对本方法进行特异性、敏感性和重复性实验，并将本方法与传统ELISA方法进行敏感性比较。经过实验证明，本方法简便、快速、特异性强、稳定性好，并且本方法和传统ELISA方法的敏感性相当。同时用建立的方法检测北京市朝阳区新生养殖场鸡群咽部棉拭子样品30份。检测时样品设立阴性、阳性对照。并与双抗体夹心ELISA方法测定结果进行对照，二者30份样品的检测结果均为阴性。微流控芯片技术是上个世纪90年代发展起来的分析前沿，可提供一种更为简便、快速、准确的分析手段。与流式细胞术的结合，利用微球在鞘液的束缚下排成一列逐个流动而在检测区实现单点捕获信号的原理，为实现疫病快速诊断提供了新的思路。本文介绍了基于建立的检测模式，采用羟丙基甲基纤维素(HPMC)的磷酸盐溶液为缓冲体系和鞘液。初步应用微流控芯片进一步检测了禽流感病毒，该方法实现了禽流感病毒的快速检测。本研究样品和试剂消耗少，成本低廉，为采用微芯片流式细胞术对多种动物疾病同时检测方法的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 禽流感概述
• 1.1 引言
• 1.2 病原学研究
• 1.3 我国禽流感（AI）的流行状况
• 1.4 禽流感对养禽业的危害
• 2.诊断与检测方法的研究
• 2.1 病毒分离及鉴定
• 2.2 血清学诊断技术
• 2.3 分子生物学诊断技术
• 2.4 电镜技术
• 3.流式细胞术的研究进展与应用
• 3.1 流式细胞术的原理
• 3.2 流式细胞术分析方法的进展
• 3.3 高分子微球在流式细胞术中的应用
• 4.微流控芯片的研究进展
• 4.1 微流控芯片的基本原理和主要特征
• 4.2 微流控芯片流式细胞术的研究应用
• 第二章 实验内容
• 实验一 禽流感病毒流式微球免疫检测方法的研究
• 1.引言
• 2.实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 实验方法
• 3.结果
• 3.1 禽流感多克隆抗体的纯化结果
• 3.2 AI抗体的蛋白含量的测定结果
• 3.3 夹心ELISA筛选结果
• 3.4 荧光微球检测禽流感方法的建立
• 4.讨论
• 4.1 关于荧光微球与单克隆抗体的连接
• 4.2 关于微球检测方法和传统ELISA方法敏感性比较
• 4.3 关于微球检测方法的特异性和数据的稳定性
• 4.4 关于微球检测方法的优点
• 4.5 荧光微球检测时的注意问题
• 5.小结
• 实验二 初步应用微流控芯片检测禽流感病毒
• 1.引言
• 2.实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 实验方法
• 3.结果与分析
• 3.1 微流控芯片免疫诊断仪对荧光微球的检测
• 3.2 微流控芯片免疫诊断仪对禽流感阳性抗原的检测
• 3.3 微流控芯片免疫诊断仪对禽流感阴性抗原的检测
• 4.讨论
• 4.1 加入HPMC的作用
• 4.2 微流控芯片检测的优点与不足
• 5.小结
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介