论文摘要
类大麦属作为小麦族中较为少见的单种属,在其系统进化方面研究较多,而对其种子贮藏蛋白的研究尚未见报道。为了深入了解类大麦属物种贮藏蛋白及其编码基因,对类大麦属材料毛节草（Crithopsis delileana）的种子贮藏蛋白分别进行了分析与鉴定,并且对部分编码基因进行了克隆和测序,对其高分子量谷蛋白亚基（how-molecular-weight glutenin subunits,HMW-GS）Kx基因进行了表达分析。本研究所获主要结果如下:1.毛节草种子贮藏蛋白SDS-PAGE和A-PAGE分析对2份毛节草材料种子贮藏蛋白进行了SDS-PAGE和A-PAGE分析。利用三种不同的提取方法进行SDS-PAGE分析结果表明,普通提取方法中2份材料在小麦的高分子量谷蛋白区域均仅有一条带,电泳迁移率介于普通小麦By8和Dy10亚基之间,推测为一个高分子量谷蛋白亚基。在普通小麦的低分子量谷蛋白区域,出现若干条分辨率不高的蛋白条带。通过丙酮沉淀法提取分析,发现HMW-GS沉淀中只有电泳迁移率介于普通小麦By8和Dy10亚基之间的带存在,初步确认毛节草中只有一种高分子量谷蛋白亚基。A-PAGE分析表明毛节草种子醇溶蛋白存在着一些变异类型,与普通小麦中国春相应的α、γ和ω醇溶蛋白区域的电泳迁移率有一定差异。2、HMW-GS基因克隆与序列分析利用已知HMW-GS基因序列设计特异性引物,对1份毛节草材料的基因组DNA进行扩增得到两个长度分别为2.1和1.7kb的片段,经过序列分析表明2.1kb片段为Kx亚基编码基因,而1.7kb片段为Ky亚基（未表达）的编码基因。Genebank登录号分别为AY804128和AY834230。Kx基因全长编码区长度为2046bp,由其推导的氨基酸序列含682个氨基酸残基,具有x型HMW-GS的典型特征,包括21个氨基酸残基组成的信号肽,86个氨基酸残基组成的N-端保守区,533个氨基酸残基组成的重复区,42个氨基酸残基组成的C-端保守区。N和C-端保守区内分别含3个和1个半胱氨酸（C）。重复区内,含有9个三肽（GQQ）、56个六肽（PGQGQQ）、16个九肽（GYYPTSLQQ）,以及位于重复区起始端的十二肽（RYYPSVTSSQQA）和十一肽（SYYPGQASPQR）和重复区末端的三肽（GYD）。与其它亚基序列进行比较发现它与已知高分子量谷蛋白亚基间的主要差异在重复区内,且集中表现为可重复短肽类型和数目的增加或减少,以及可重复单元内个别座位氨基酸的替换和少量部位的缺失。目前,在已知x型高分子量谷蛋白亚基中,Kx的长度是最短的。Ky亚基的全长序列长度为1725bp,由其推导的氨基酸序列同样具有y型高分子量谷蛋白序列的典型特征。但在核苷酸序列中的1558位置上存在一个提前终止密码子,它的存在可能导致Ky编码基因沉默,从而导致Ky亚基不能得到表达。3、LMW-GS基因克隆与序列分析利用已知LMW-GS基因序列保守区设计一系列引物对毛节草基因组DNA进行扩增,成功克隆了4个LMW-GS基因LMW-GSK1、LMW-GSK2、LMW-GSK3和LMW-GSK4,Genbank序列号依次为EU283813、EU283814、EU283815和EU283816。其中LMW-GSK3和LMW-GSK4为部分基因序列。同小麦族其它LMW-GS基因进行比对分析后发现,其5’侧翼序列和氨基酸序列同其它亚基存在较高的一致性,同样具备LMW-GS的典型特征,同时也存在着一定的结构差异,这些差异主要来源于氨基酸残基的替换以及重复区结构单元的缺失或插入。在LMW-GSK1基因序列5’侧翼区发现了2个顺式作用元件EM（5’-TGTAAAGT-3’）和GLM（5’-GGCGAGTCAT-3’）、2个TATA box、1个CAAT box和1个AGGA box。其推导的氨基酸序列具有一个由20个氨基酸残基组成的信号肽,一个15个氨基酸残基组成的N端保守区,一个由80个氨基酸组成的重复区和一个由182个氨基酸残基组成的C端保守区。LMW-GSK2和LMW-GSK4编码区内部均发现了提前终止密码子,故推测它们为假基因。根据所克隆基因的5’侧翼序列和保守区氨基酸序列同小麦族其他LMW-GS相应序列的比对结果进行分子进化分析表明,来源于K染色体组的LMW-GS可以和小麦A、D染色体组以及黑麦的R和大麦的H染色体组分别聚为关系相对较近的类群。4.醇溶蛋白基因分子克隆与序列分析根据小麦族已知α和γ醇溶蛋白基因保守区设计引物,对毛节草进行PCR扩增,成功获得了3个α醇溶蛋白基因gli-Kal、gli-Ka2和gli-Ka3,Genbank登录号分别为EU283817、EU283819和EU283820;2个γ醇溶蛋白基因gli-KrI和gli-Kr2,Genbank登录号分别为EU283818和EU283821。因在gli-Ka3编码区内发现了1个提前终止密码子,故推测其为假基因。毛节草的3个α醇溶蛋白基因与来源于小麦属普通小麦、乌拉尔图小麦和野生二粒小麦,以及具有S和H染色体组的披碱草属老芒麦、具有D染色体组的粗山羊草、具有W染色体组的澳冰草、具有V染色体组的簇毛麦和具有Ee染色体组的偃麦草属的相应基因进行比较发现它们在结构上有着较高的相似性,同时也存在着一定的差异,这些差异主要来源于氨基酸残基以及重复区内重复单元的的替换、缺失和插入。一致性分析表明3个基因推导的氨基酸序列同其它小麦族相应基因氨基酸序列的相似性在57.59%-88.18%范围内变化。2个γ醇溶蛋白基因与来源于小麦属不同品种相应基因之间同样具有较高的相似性,其一致性在62.41%-85.53%范围内变化。保守区进化分析表明,3个α醇溶蛋白单独聚为一类,其同时与具有Ee染色体组的偃麦草属的α醇溶蛋白基因亲缘关系最近,其次与普通小麦的α醇溶蛋白基因亲缘关系最近;2个γ醇溶蛋白同样单独聚为一类,同时与来自于普通小麦品种Bobwhite的γ醇溶蛋白基因亲缘关系最近。5.HMW-GS基因Kx体外表达与植物转基因载体构建根据Kx基因编码区序列设计表达引物,扩增其切除信号肽部分的全长编码区后连接入pET-30a表达专用载体后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导后Kx基因在细菌中获得表达,且表达产物电泳迁移率同种子蛋白中唯一的高分子量谷蛋白亚基相一致。进一步设计遗传转化载体构建所需引物,扩增其全长编码区后连接入遗传转化专用载体pCMBIA1302中,经PCR、双酶切和测序验证了载体构建成功,为进一步利用转基因手段研究Kx与小麦品质的关系奠定了基础。