中国中部地区人类免疫缺陷病毒流行株HIV-1 B’的全长基因组序列比较分析及其侵染性克隆的构建

论文题目: 中国中部地区人类免疫缺陷病毒流行株HIV-1 B’的全长基因组序列比较分析及其侵染性克隆的构建

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 刘利

导师: 张林琦,陈志伟

关键词: 亚型,全长基因组,侵染性全长分子克隆

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 我们前期的工作证明,中国主要存在两种HIV-1亚型流行株,一种是流行于河南有偿献血人群(PBD)中的B`亚型,另一种是流行于云南、广西和新疆的静脉吸毒人群(IDU)中的CRF07和08 CB`重组亚型。本研究是我们前期工作的延伸。我们对2002年来自河南的不同地区的3个有偿献血者体内的HIV-1全长基因组进行了分离和系统地分析,获得了国际上第一株来自中国河南地区有偿献血人群中的HIV-1的全长基因组,证明流行于河南的B`亚型毒株没有流行于中国其他地区或者世界上任何其它地区的HIV-1毒株发生重组。之后,我们又进一步获得了3个HIV-1 B`毒株的全长基因组,并在此基础上成功构建了中国第一株侵染性全长分子克降,同时也是世界上首株HIV-1 B`侵染性克隆。对3个有偿献血者体内的HIV-1全长基因组的系统分析发现,这3个克隆彼此之间极其相似,并与分离自中国云南和河南的HIV-1 B`毒株关系紧密。对3个全长基因组序列的重组分析进一步很好的证实了我们先前的结论,即河南省的HIV-1 B`毒株没有与流行于中国的其他亚型毒株发生重组的迹象。3个有偿献血者尽管来自河南的不同地区但是体内的HIV-1全长基因组序列及其相似这一特性表明,河南省得HIV-1很可能来源于一个共同的单一的毒株,在传入河南后才扩敞到其他地区。3个克隆中的两个具有所有已知的病毒的结构和功能蛋白的完整的开放阅读框,没有在蛋白酶和逆转录酶基因上发现耐药突变,与样品取自中国开始全国范围内的免费抗逆转录病毒治疗之前的时间相一致。大多数有效中和抗体识别的抗原决定簇也很保守。完成全长基因组序列分析后,利用获得的来自3个PBD的HIV-1 B`基因组片断,我们用常规克隆技术构建了6个HIV-1 B`亚型侵染性全长分子克隆。其中2个克隆来自单一病人,另外4个是用来自不同的病人的HIV-1 B`基因组片断组合成的嵌合病毒。6个克隆都为R5嗜性,能有效感染TZM-b1细胞并激活报告基因的表达。病毒在体外细胞中的复制动力学研究初步表明6个病毒都能够在CEM×174-5.25M7细胞中有效复制,5个克隆能够在人外周血单核细胞中复制,其中02HNsq4-11A和02HNsq4-sc11-smx2较其它克隆显示更好的体外细胞中的复制能力。我们相信,本研究中提供的全长基因组信息将对未来设计和发展针对对中国中部地区的有效的疫苗和抗逆转录病毒药物意义重大。构建的侵染性克隆也将成为研究中国中部地区HIV-1生物特性和测试针对此地区的HIV-1的疫苗和药物的重要工具。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

引言

第一章 文献综述

一 HIV颗粒

1.1 HIV基因组RNA

1.2 HIV的转录和蛋白

1.3 HIV的LTR和15个蛋白质的功能

1.3.1 长末端重复区(long terminal repeat，LTR)

1.3.2 病毒调节蛋白

Tat(Transactivator)

Rev(Regulator of viral protein)

1.3.3 病毒附属蛋白

Vpu(Viral protein U)

Nef(Negative regulation factor)

Vif(viral infectivity factor)

Vpr(viral protein R)

1.3.4 病毒结构蛋白

基质蛋白MA，matrix)

衣壳蛋白(CA，capsid)

核衣壳(NC，nucleocapsid)

p6蛋白

1.3.5 病毒酶

蛋白酶(PR，protease)

逆转录酶(RT，reverse transcriptase)

整合酶(IN，integrase)

1.3.6 病毒表面膜蛋白

表面膜蛋白(SU，surface gp120)

跨膜蛋白(TM，gp41)

1.4 HIV-1的复制周期

病毒感染新细胞

病毒基因组整合入染色体

病毒基因的表达

产生病毒颗粒

1.5 HIV-1复制的细胞内调控

1.6 HIV-1的高度变异性

二 HIV-1的遗传型

2.1 现有亚型

2.2 亚型的定义

2.3 M组

2.4 O组

2.5 HIV-1遗传型的地理分布

2.6 HIV-1遗传亚型的研究方法

策略

测序

系统进化树分析

2.7 亚型和流行病学

三 HIV多样性与生物学特性、传染能力和致病性

四 HIV多样性与药物治疗

4.1 各个亚型对于抗病毒药物敏感性的差别

4.2 耐药突变对抗病毒药物的影响

五 HIV-1 遗传多样性与疫苗研发

5.1 HIV-1亚型和中和抗体反应

5.2 HIV-1亚型和细胞介导的免疫反应

5.3 在动物模型中对攻击性保护的研究

六 构建中国中部地区的HIV-1流行株全长分子克隆和侵染性克隆的背景、目的和意义

第二章 实验研究

一 研究对象

二 研究试材

2.1 细胞系和菌种

细胞系

菌种

2.2 细胞培养试剂

2.3 特殊细胞培养及相关缓冲液配方

2.4 细菌培养基

2.5 工具酶

2.6 PCR反应

2.7 试剂盒

2.8 质粒提取相关溶液

2.9 感受态细胞制备溶液

2.10 蛋白质凝胶电泳和免疫印迹

2.11 Luciferase Assay

2.12 主要试验仪器：

三 研究方法

3.1 从HIV-1阳性患者外周血单细跑(PBMC)中分离基因组DNA

3.1.1 外周血单核细胞(PBMC)的分离与培养

3.2.2 HIV-1阳性患者外周血单核细胞(PBMC)与健康人的外周血单核细胞共培养：

3.1.3 HIV-1阳性患者的外周血单核细胞中提取基因组DNA

3.2 巢式聚合酶链式反应(PCR)分离HIV-1基因组DNA

3.2.1 引物的设计

3.2.2 巢式PCR方法分离HIV-1基因组DNA

3.3 HIV-1基因组DNA的克隆

3.3.1 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化PCR产物

3.3.2 分离纯化后的PCR产物克隆入T载体

3.3.2.1 菌种的活化与保存

3.3.2.2 大肠杆菌高效感受态细胞的制备

3.3.2.3 质粒的转化

3.3.2.4 质粒DNA的提取

3.3.2.5 限制性内切酶反应

3.3.2.6 载体去磷酸化

3.3.2.7 PCR或酶反应产物去除缓冲液

3.3.2.8 PCR或酶切产物片断克隆入质粒载体

3.4 HIV-1全长基因组序列测定、比对与分析

3.5 HIV-1侵染性分子克隆的构建

3.5.1 HIV-1全长基因组序列酶切图谱分析

3.5.2 构建HIV-1侵染性克隆

3.5.2.1 构建02HNsq4的5`端克隆：5`-02HNsq4

3.5.2.2 构建02HNsc11的5`端克隆：5`-02HNsc11

3.5.2.3 构建02HNsc11的3`端克隆：3`-02HNsc11

3.5.2.4 利有02HNsmx2的ENV基因序列，改造3`-02HNsc11，构建镶嵌3`端克隆：3`-02HNsc11-smx2

3.6 传代细施的培养冻存和复苏

3.7 HIV-1侵染性克隆转染293T细胞产生并收获HIV-1病毒

3.7.1 去内毒素试剂盒提取HIV-1侵染性克隆质粒DNA

3.7.2 HIV-1侵染性克隆转染293T细胞产生并收获HIV-1病毒(图

3.8 CEM174.5.25细胞增殖HIV-1病毒

3.9 转染后的293T与HOS-CD4-CCR5和HOS-CD4-CXCR4的细胞融合试验

3.10 使用p24抗原ELISA检测试剂盒定量病毒

3.11 基于TZM-b1细胞的荧光素酶反应测定病毒感染性

3.12 蛋白质凝胶电泳和免疫印迹检测病毒蛋白质表达

3.12.1 HIV阳性血清体外灭活

3.12.2 病毒裂解液样品制备

3.12.3 蛋白质质凝胶电泳

3.12.4 免疫印迹检测病毒蛋白质表达

四 研究结果

4.1 所有3个来自河南省的HIV-1全长克隆都是B’亚型

4.2 3个河南HIV-1全长基因组中的功能结构域分析

4.3 HIV-1B’侵染性克隆的构建及其生物特性的初步研究

4.4 HIV-1B’侵染性克隆的感染靶细胞能力和复制能力的初步研究

第三章 讨论

中外文参考文献

博士期间已发表和待发表论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

• [1].猪源乙型脑炎病毒SXBJ07株全长基因组克隆分析及ELISA检测方法的建立[D]. 王（韦华）.西北农林科技大学2009

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