产外切葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定及其基因在毕赤酵母中的表达

论文摘要

纤维素酶是一组复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和p一葡萄糖苷酶,上述三种酶通过协同作用将纤维素转化成葡萄糖。木质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在,外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶,在木质纤维素降解成还原糖的过程中,外切葡聚糖酶起着非常关键的作用。因此外切葡聚糖酶基因的克隆表达,对于研究纤维素酶的降解机制有着十分重要的意义。本实验从四川农业大学老板山腐木中采集土样,筛选到一株高产外切葡聚糖酶的黑曲霉Asp-524,克隆其葡聚糖外切酶基因序列后,构建了诱导型表达载体,并实现了该基因在毕赤酵母的中的表达。1.本实验从四川农业大学老板山腐木中采集土样,筛选到高产外切葡聚糖酶的4株真菌。其中菌株Asp-524外切葡聚糖酶活力最高,为5.1U/mL。因此选取Asp-524为研究对象。对其进行形态观察：菌落初为白色,后变成鲜黄色直至黑色厚绒状；背面无色或中央略带黄褐色；菌丝发达多分枝,有隔多核；分生孢子头褐黑色放射状,分生孢子梗长短不一；顶囊球形,双层小梗。以Asp-524基因组为模板通过PCR扩增得到长度为599bp的ITS序列,利用MEGA4.0软件以Neighbor-Joining计算方式生成系统发育进化树,分析证明Asp-524同黑曲霉的ITS同源性达99%,因此鉴定Asp-524为黑曲霉（Aspergillus Niger）。2.以Asp-524为出发菌株,根据GenBank中公布的Aspergillus Niger An01c0340基因组序列,分别以Asp-524 DNA和总RNA为模板,用PCR和RT-PCR的方法扩增得到了大小均为1611bp的编码外切葡聚糖酶的基因组序列（gDNA）和cDNA序列（GenBank Accession No.HQ604862）,并命名为cbhB。通过比对cbhB基因组序列（gDNA）和cDNA序列,结合GenBank数据库分析证明该基因不含内含子。3.构建诱导型表达载体。本实验设计了融合表达引物和非融合表达引物。去掉基因本身信号肽序列,在上下游两端分别引入酶切位点（上游XbaⅠ酶切位点,下游SacⅡ酶切位点）,双酶切后连接到诱导型表达载体pPICZa-A上,得到融合表达载体S-pPICZaA-cbhB和非融合表达载体N-pPICZaA-cbhB。4.将重组质粒pPICZaA-cbhB转化大肠杆菌DH5α,获得阳性转化子,提取质粒,经SacⅠ线性化后,电转化酵母GS115,筛选出阳性转化子,实现cbhB基因在酵母中的分泌表达。筛选得到的转化子都具有外切葡聚糖酶活性。其中G-S-7（融合表达）和G-N一10（非融合表达）菌株表达效率最高,用1%甲醇诱导5天后,酶活分别达到了3.29U／mL和3.14UmL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 引言
• 1.1 纤维素酶的概述
• 1.1.1 纤维素酶系的组成及作用
• 1.1.2 纤维素酶的作用机理
• 1.1.3 纤维素酶的来源
• 1.1.4 纤维素酶的应用
• 1.1.5 纤维素酶存在的问题及发展方向
• 1.2 纤维素酶的异源表达
• 1.2.1 纤维素酶异源表达的研究现状
• 1.2.2 本研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及载体
• 2.1.2 试剂及酶类
• 2.1.3 常用试剂的配制
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 高产外切葡聚糖酶真菌的筛选鉴定
• 2.2.2 外切葡聚糖酶基因cbhB的克隆
• 2.2.3 毕赤酵母表达载体的构建
• 2.2.4 毕赤酵母表达载体的转化
• 2.2.5 重组酵母的表达
• 2.2.6 重组外切葡聚糖酶酶学性质分析
• 3 结果与分析
• 3.1 外切葡聚糖酶高产菌株的筛选
• 3.1.1 菌株鉴定
• 3.1.2 酶活测定
• 3.2 cbhB基因的克隆
• 3.2.1 cbhB基因的克隆
• 3.2.2 黑曲霉cbhB基因的序列分析
• 3.3 诱导型表达载体pPICZαA-cbh的构建
• 3.4. 诱导型表达载体的转化、筛选、鉴定
• 3.5 cbhB基因在毕赤酵母中的表达
• 3.5.1 诱导型表达载体pPICZαA-cbh的表达
• 3.5.2 SDS-PAGE
• 3.6 重组外切葡聚糖酶的酶学性质分析
• 3.6.1 重组外切葡聚糖酶的最适反应pH和pH稳定性
• 3.6.2 重组外切葡聚糖酶的最适反应温度
• 4. 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的文章