发育期PFOS暴露的肺损伤效应及机制研究

论文摘要

第一部分胚胎期全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露致SD仔鼠肺损伤及其机制研究目的：由于宫内PFOS暴露导致的子代死亡风险增加可能与PFOS的肺毒性相关,因此本研究旨在探讨胚胎期PFOS暴露致仔鼠肺损伤及可能的毒性机制。方法：将雌、雄性成熟SD大鼠按2：1合笼后,经阴道涂片筛选受孕的雌鼠。然后将孕鼠随机分为对照组（0.05% Tween-20）、低剂量组（0.1 mg/kg/day PFOS）、高剂量组（2 mg/kg/day PFOS）。从母鼠受孕后第2天（gestational day 1, GD1）开始进行PFOS灌胃染毒,直至分娩结束。染毒体积为1 ml/kg。对出生后的仔鼠观察其3日内存活率及初生至断奶期间的体重增长情况。同时将初生（PND0）和断奶期（PND 21）仔鼠经麻醉后处死,收集血液、肺脏等主要脏器。采用液相色谱-质谱串联（LC/MS/MS）分析血清及肺脏组织中PFOS的浓度,用H&E染色法、TUNEL技术、Real-time PCR、western blotting、酶学技术等分别检测肺脏的病理学改变、肺部细胞凋亡、细胞凋亡调控分子mRNA表达水平、cyt c蛋白的释放、caspase 3、8、9的酶活力,同时还检测了肺脏中MDA水平、GSH的含量以及SOD酶的活力等氧化损伤相关指标。结果：与对照组和低剂量组相比,孕鼠妊娠期高剂量PFOS暴露能明显诱导PND0和PND 21仔鼠肺脏肺泡出血、肺间隔增厚、炎性浸润、肺实变等病理学改变,TUNEL显示高剂量组仔鼠肺组织出现明显的细胞凋亡（P<0.01）。胚胎期高剂量PFOS暴露组仔鼠肺脏Bax、Fas以及FasL的：mRNA表达在PND 0和21明显上调（P<0.01）,Bcl-2 mRNA水平在PND 0显著下调（P<0.01）,而且胞浆cyt c蛋白的释放水平在PND 0和PND 21均明显增加（P<0.01）, caspase 3、8、9酶的活力在PND 0和21也显著提高（P<0.01）；此外,高剂量组仔鼠肺脏在PND 0和PND 21 MDA水平明显增加（P<0.01）、还原性生物分子GSH的含量显著减少、抗氧化酶SOD活力下降（P<0.01）。在低剂量组,仔鼠肺组织中没有明显的病理改变和细胞凋亡,3种caspase酶的活力没有明显改变,只是PND 0仔鼠肺脏的bax mRNA表达和MDA水平,以及PND 21肺脏Fas mRNA表达会轻微上调（P<0.05）。结论：宫内PFOS暴露能够引起仔鼠肺组织的损伤,而且这种损伤具有一定的持续性。本实验证实氧化应激损伤和细胞程序性死亡参与了肺组织的损伤过程,而且内源性和外源性凋亡通路均被活化。第二部分ROS介导的线粒体损伤在PFOS致A549细胞凋亡中的作用研究目的：在第一部分的动物研究结果显示,氧化损伤和细胞凋亡在胚胎期PFOS暴露致仔鼠肺损伤中起到了非常重要的作用。但尚不能断定这些损伤效应是PFOS对肺组织的直接毒作用。因此,该部分通过建立体外细胞染毒模型,探讨PFOS对肺上皮细胞株A549的直接毒效应。方法：通过将A549细胞在1%血清浓度培养基培养条件下,暴露于不同浓度的PFOS （0、12.5、25、50、100、200μM）一定时间后,用MTT法、流式细胞术、DCFH-DA荧光探针、JC-1荧光探针等分别检测细胞活力、细胞凋亡率、胞内ROS的产生以及线粒体膜电位；此外还检测了MDA水平、GSH含量以及SOD酶活力等氧化应激指标；用酶学的方法还检测了caspase 3、caspase 8、caspase 9三种酶的活力。此外,还探讨了用还原剂NAC预处理后,通过检测ROS的产生、细胞活力和凋亡率,看ROS是否介导了PFOS的毒效应。最后,还初步研究了不同血清浓度下（1%和10%） PFOS的毒性差异。结果：与溶剂对照组相比,A549细胞在低血清环境下（1%）经不同浓度的PFOS处理24-72 h后,细胞活力呈剂量和时间依赖性下降。此外,在该血清浓度下暴露于PFOS,细胞凋亡率、ROS的产生、MDA水平、SOD酶活力、caspase 3和caspase 9的活力呈剂量依赖性增加,同时,胞内GSH含量和线粒体膜电位均下降。但各暴露组细胞胞内caspase 8的活力并没有上升,甚至在低剂量组还有轻度下降。NAC预处理能显著抑制PFOS诱导的ROS的产生、细胞活力下降以及细胞凋亡。另外,在10%血清浓度培养条件下暴露于PFOS,只有最高剂量组（200μM）细胞出现活力下降,而且高血清能显著抑制200 pM PFOS造成的细胞凋亡。结论：PFOS通过ROS介导的内源性细胞凋亡通路诱导A549细胞凋亡。同时高血清培养条件能够抑制PFOS的细胞毒性,可能与血清蛋白结合PFOS有关,或许这可以用来解释发育期PFOS暴露比成年期暴露更敏感的原因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词汇表
• 第一部分 胚胎期全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露致SD仔鼠肺损伤及其机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 ROS介导的线粒体损伤在PFOS致A549细胞凋亡中的作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢