蛋白酶体活性与突变亨廷顿蛋白聚集物累积及其细胞毒性的关系

论文摘要

亨廷顿病（Huntington’s Disease, HD）是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病,主要发生在中老年人群,由HD基因突变即HD基因第一外显子中CAG重复序列异常延伸,因而其表达产物—亨廷顿蛋白（huntingtin,Htt）氨基末端中谷氨酰胺异常延伸所致。正常Htt弥散分布在神经元胞质内,而在HD患者和HD动物模型脑内,突变Htt形成不溶性聚集物定位在神经元核内和突起（包括轴突和轴突终末）内,分别称为核内聚集物（intranuclear aggregates）和神经毡聚集物（neuropil aggregates）。不溶性聚集物是否与HD神经退行性变有关,或者聚集物的形成是否可因将具有潜在毒性的多肽隔离而降低毒性,目前仍有争议。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）是机体内两大细胞内蛋白酶系统之一,它清除异常或折叠错误的蛋白质,保护细胞免受聚集蛋白的毒性作用。如果泛素-蛋白酶体系统的功能受损,蛋白质因不能正确折叠而形成大量聚集物,或者聚集物因不能被降解而大量累积。有研究表明,突变Htt聚集物的累积与UPS功能损害有关,因此泛素-蛋白酶体系统功能减退可能是HD发病的机制之一。然而,突变蛋白聚集、UPS功能障碍、神经细胞退行性变之间的关系目前仍未明了。神经退行性病变中有反应性氧化物（Reactive Oxidative Species, ROS）增加,氧化应激参与HD的病理过程,并可影响UPS功能。但突变Htt是否通过氧化应激损害UPS功能导致突变Htt聚集物的累积继而产生细胞毒性,目前尚不清楚。本研究在明确蛋抑制白酶体活性能促进突变Htt聚集物累积的基础上,进一步证明了突变Htt聚集物的细胞毒性,突变Htt对蛋白酶体活性的影响及氧化应激在突变Htt影响蛋白酶体活性中的作用。一、抑制蛋白酶体活性对突变Htt聚集物形成的影响将表达带绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白DsRed2标记的正常（20Q）Htt和突变（120Q）Htt氨基末端片段的质粒pEGFP-Htt-20Q和pEGFP-Htt-120Q分别转染HEK293细胞,G418筛选后建立稳定细胞系。荧光显微镜观察, 20Q Htt弥散分布在胞质内,未见或偶见聚集物,而120Q Htt在部分细胞胞质内形成聚集物。用蛋白酶体抑制剂N-Acetyl-Leu-Leu-Norleu-al （ALLN）处理20Q和120Q细胞,荧光显微镜下观察到,随着ALLN作用时间和剂量的增加,120Q细胞系含有聚集物的细胞数量明显增加,而20Q细胞内未见聚集物形成或偶见聚集物。免疫印迹检测显示,随着ALLN作用时间和剂量的增加,120Q细胞中聚集型Htt逐渐增加,可溶型Htt逐渐减少。由此表明,突变Htt聚集物的形成与蛋白酶体活性的降低有关。为了能直观、动态监测活细胞内蛋白酶体活性,构建表达含蛋白酶体降解信号（CL1）的EGFP或DsRed2的质粒pEGFP-CL1和pCL1-DsRed2,将2种质粒分别转染HEK293细胞并筛选单克隆稳定细胞系GFPu细胞和DsRed2u细胞。ALLN处理细胞系后,用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和免疫印迹技术检测GFP和DsRed2荧光强度或GFPu和DsRed2u含量的变化。ALLN处理后,GFPu细胞和DsRed2u细胞中相应荧光强度随着ALLN作用时间的延长或浓度的增加而增强,荧光蛋白含量也增加。因此,GFPu和DsRed2u细胞系可作为直观、动态、简便监测蛋白酶体活性的细胞系,细胞系中相应荧光强度和荧光蛋白含量能间接反映蛋白酶体活性,荧光强度或荧光蛋白含量与蛋白酶体活性成负相关。为了进一步说明蛋白酶体活性变化和突变Htt聚集物形成的关系,分别将表达带DsRed2标记的20Q Htt和120QHtt的质粒pDsRed2-20Q和pDsRed2-120Q瞬时转染GFPu细胞,并用ALLN处理细胞。激光共聚焦显微镜和免疫印迹技术检测发现,随着ALLN作用时间的延长或浓度的增加,转染120Q的细胞内Htt聚集物和GFP荧光强度或蛋白水平呈同步增强或增加,由此进一步证明蛋白酶体活性的下降能明显促进突变Htt聚集物的形成。二、抑制蛋白酶体活性对突变Htt细胞毒性的影响MTT比色法检测表明,120Q稳定细胞系的活力较20Q稳定细胞系明显降低;在ALLN处理后,20Q细胞和120Q细胞活力均随着ALLN作用时间和剂量的增加而下降,但150Q细胞活力的下降较20Q细胞更加明显。将pEGFP-Htt-20Q和pEGFP-Htt-120Q转染表达Caspase-3荧光共振能量转移（FRET）探针的Hela稳定细胞系,结果显示有120Q-Htt聚集物的细胞内FRET现象明显下降,有弥散型120Q-Htt细胞内FRET现象也有下降,但是不如有120Q-Htt聚集物的细胞内明显,20Q-Htt不影响FRET现象的发生。说明突变Htt可以激活Caspase-3,诱导细胞调亡。用表达Caspase-3 FRET探针的质粒分别转染20Q和120Q稳定细胞,ALLN处理后,20Q细胞中FRET的发生较处理前轻度减少,120Q细胞中FRET的发生则较处理前明显减少。将表达Caspase-3 FRET探针的质粒分别和pDsRed2-Htt-20Q、pDsRed2-Htt-120Q质粒共转染GFPu细胞, ALLN处理后,发现转染120Q质粒的细胞内聚集物较处理前增加,GFPu荧光强度较处理前增强,FRET现象较处理前明显减少;转染20Q质粒的细胞中GFPu荧光强度较处理前增强,但FRET现象较处理前仅轻度减少。上述结果提示,蛋白酶体抑制剂促进突变Htt聚集物依赖性的细胞毒性,包括诱导细胞凋亡。三、氧化应激在突变Htt影响蛋白酶体活性中的作用为了明确突变Htt对蛋白酶体活性的影响,将pDsRed2-Htt-20Q、pDsRed2-Htt-120Q质粒分别转染GFPu细胞系后,荧光显微镜/激光扫描共聚焦显微镜和免疫印迹技术检测GFP的荧光强度和蛋白水平。结果显示,表达20Q-Htt的细胞GFP的荧光强度和蛋白水平无明显变化,而表达120Q-Htt的细胞其GFP荧光强度明显增强,有聚集物者更为明显,GFP蛋白水平明显升高。由此证明突变Htt能抑制蛋白酶体活性。用H2O2处理GFPu细胞后,荧光显微镜观察和免疫印迹检测均发现GFP水平明显升高。将pDsRed2-Htt-20Q、pDsRed2-Htt-120Q转染GFPu稳定细胞系,分别用H2O2、H2O2+Eda和Eda处理后,激光扫描共聚焦显微镜和免疫印迹检测发,现Eda使Htt-120Q升高GFPu的作用明显减弱,Htt聚集物减少。将pDsRed2-Htt-20Q和pDsRed2-Htt-120Q分别转染GFPu细胞系后,分别用H2O2、H2O2+自由基清除剂Edaravone（Eda）和Eda处理细胞,24h后用MTT比色法进行细胞活力检测。结果显示H2O2可明显降低分别转染pDsRed2-Htt-20Q和pDsRed2-Htt-120Q的细胞的活力,Eda能明显抑制H2O2和突变Htt降低细胞活力的作用,尤以120Q细胞中为明显。将pEGFP-Htt-20Q和pEGFP-Htt-120Q质粒转染表达Caspase-3 FRET探针的Hela稳定细胞系,分别用H2O2、H2O2+Eda和Eda处理后进行FRET检测。结果显示,在分别转染pDsRed2-Htt-20Q和pDsRed2-Htt-120Q的细胞中,H2O2处理可明显减少FRET的发生,H2O2和Eda共处理后FRET的发生较单纯H2O2处理明显增加;在转染pDsRed2-Htt-120Q的细胞中,单纯Eda处理能明显增加FRET的发生。上述结果表明,突变Htt可通过氧化应激抑制蛋白酶体的活性或损害蛋白酶体的功能,白酶体的活性或功能损害使突变Htt聚集物的降解减少而大量累积,继而产生包括细胞凋亡在内的细胞毒性。结论:突变Htt通过氧化应激抑制蛋白酶体的活性或损害蛋白酶体的功能,使神经元内聚集的突变Htt不能降解而导致神经元退行性变,可能是HD发病的重要机制之一。Eda等自由基清除剂可通过清除自由基而保护蛋白酶体的活性或功能,因此可能对具有治疗作用。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 一、抑制蛋白酶体活性对突变Htt聚集物的影响
• 二、抑制蛋白酶体活性对突变Htt细胞毒性的影响
• 三、氧化应激在突变Htt影响蛋白酶体活性中的作用
• 讨论
• 一、突变Htt 聚集物的形成与蛋白酶体活性下降有关
• 二、蛋白酶体活性降低可促进突变Htt 的细胞毒性
• 三、氧化应激介导突变Htt 对蛋白酶体活性的影响
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢