髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）对重症急性胰腺炎继发感染的诊断价值和分子治疗应用

论文摘要

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是一种病因复杂、发病机制不明、病情凶险、治疗棘手的急腹症,是临床常见的内外科急症。SAP发病率近年呈现不断上升趋势,以加强监护为主的个体化治疗原则在SAP的治疗中已经被广泛接受,临床疗效有明显提高,但病死率仍高达20—30%。SAP存在着两个死亡高峰,第一个由SIRS引起,多发生在病程第一周,第二个是由感染引起,多发生在1—3周,占病死率的80—90%。如何早期判定感染的发生,成为人们争论的焦点。需要注意到的是,不加选择地应用抗生素,长时间地应用广谱抗生素都会增加菌株耐药和二重感染的概率,延长ICU住院时间,增加死亡率。有胰腺组织坏死不一定有感染,不是手术的绝对指征,但非手术治疗胰腺感染失败并延误手术时机的后果也是致命的。细针穿刺物和临床送检标本的细菌学检查,假性率高且等待时间长（2周左右）,以此鉴别胰腺坏死感染与否,临床上很难满意。且多数SAP的发病过程和严重程度往往不是渐进性的,时常会在短时间内急剧变化,造成多器官功能障碍。因此,张圣道、张群华、赵玉沛等教授指出,早期明确诊断SAP感染,尤其是早期识别暴发性胰腺炎是关键。SAP的综合治疗方案已形成共识,但对关键问题:如何早期诊断SAP继发感染,尚存争议。目前临床上已部分开展通过检测C反应蛋白和降钙素原等,来预测感染和判断预后,但应用价值非常有限。SAP的主要问题之一是尚无单一的血清血指标能准确地早期预示胰腺感染性坏死及精确地预测疾病严重程度。急需找到一个敏感、特异、能即时反映感染过程的指标,监测疾病进展,指导抗生素应用,掌握手术时机。髓样细胞表达的激发受体-1（Triggering receptor expressed on myeloid cellsTREM-1）属免疫球蛋白超家族。自2001年首次发现,加深了人们对炎症反应的启动和发展过程的认识。TREM-1主要分布在外周血中性粒细胞和单核细胞亚群,这些天然免疫反应的效应细胞上,还选择性地表达在肺泡、肠液及其它体液的吞噬细胞上,能特异性识别病原体的表面受体。TREM-1属跨膜糖蛋白,具有胞外区、跨膜区和较短的胞浆内尾段的保守结构。TREM-1胞外区能特异性与其配体或单克隆抗体结合,跨膜区的赖氨酸残基,可与接头蛋白DAP12跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸相耦联,并通过DAP12胞浆区中的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）来传递活化信号。Bouchon等报道,当革兰阳性菌、阴性菌或真菌所致的急性炎症和肉芽肿性炎症中,以及内毒素（LPS）或其他微生物导致的感染性休克中,感染组织中渗出的中性粒细胞和单核细胞表面的TREM-1表达明显升高。而对于那些非感染引起的免疫复合物炎症反应,如鳞癣、溃疡性结肠炎和脉管炎等,则不会出现TREM-1的表达增加。在体外,用活细菌或其胞壁成分与中性粒细胞和单核细胞共同培养,可诱导免疫细胞表面的TREM-1表达上调。TREM-1在炎症反应中的表达和诊断价值日益得到重视。TREM-1扩大了细菌及真菌所致感染的炎症反应效应,与下游细胞因子之间形成一个正反馈的自分泌调节回路,影响机体的天然免疫,促使炎症反应增强放大。TREM-1介导的信号转导通路在炎症反应的级联放大和脓毒症的发生中起着关键性的作用。THE NEW ENGLAND医学杂志上报道了通过Western的方法,快速检测患者支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-1（sTREM-1）,有助于确诊或排除细菌性或真菌性肺炎。在脓毒性休克的病人,单核细胞TREM-1表达也不断增高。TREM-1是炎症反应的潜在分子治疗靶点。根据TREM属于IgSF,TREM-1与IgG具有一定的同源性,有构想TREM-1与IgG融合蛋白综合具有此两种免疫球蛋白的特性,这种融合蛋白能与免疫细胞表面的TREM-1竞争性结合TREM-1配体,从而起抑制活化信号的作用。是目前TREM研究的热点。TREM-1对细菌/真菌引起的感染的预测诊断价值,已逐渐得到公认,其诊断价值和作为分子治疗靶点的意义仍在不断的探索之中。我国对TREM-1的研究却几近空白。SAP的发病机制,目前仍存在争议。新近提出的炎性介质参与产生的瀑布反应诱发全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征,丰富了SAP发病机制的学说。有研究检测TREM-1mRNA在轻、重型急性胰腺炎患者及正常人白细胞中表达的差异程度,结果提示TREM-1在急性胰腺炎的发生发展过程中存有重要作用。本研究拟通过SAP及其继发感染的大鼠和猪模型,分析TREM-1基因的mRNA水平表达情况,揭示TREM-1在SAP和其继发感染中的关键性作用;通过分析SAP患者外周血TREM-1的表达情况,以细菌培养为诊断标准,评估TREM-1作为SAP患者继发腹腔感染指标的诊断价值;构建人TREM1-IgG融合蛋白及大鼠TREM1-IgG融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中实现稳定表达;在大肠杆菌中大量表达并纯化大鼠TREM1-IgG融合蛋白;用于治疗SAP大鼠,验证TREM-1作为SAP分子治疗靶点的价值。更深入地了解TREM-1的信号转导机制,预测诊断SAP感染,把握手术时机,提供分子治疗靶点,为SAP发病机制探讨和综合治疗提供新思路。一、重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织TREM-1基因表达的检测目的:检测SAP大鼠胰腺组织TREM-1的表达情况。方法:雄性SD大鼠18只,随机分为假手术组（SO组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）和重症急性胰腺炎继发感染组（INP组）,各6只。采用胰管逆行注射3%牛磺胆酸钠法构建SAP大鼠模型,造模后6h腹腔注射大肠杆菌悬液构建INP大鼠模型。采用全自动生化分析仪检测血浆淀粉酶,观察各组大鼠胰腺组织病理学变化。并以real-time PCR进行相对定量检测各组大鼠胰腺组织TREM-1的mRNA水平表达情况。结果:血浆淀粉酶检测和胰腺病理改变,证实造模成功。三组均在造模后24小时,处死大鼠,无菌操作下各取出胰腺组织0.5 g,抽提总mRNA。经逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出大鼠TREM-1,扩增产物与预期目的基因长度一致,回收纯化目的产物,测序结果与GenBank公布的基因序列完全一致。Real-time PCR进行相对定量检测,INP组胰腺组织TREM-1 mRNA的相对含量显著高于SAP组,而SAP组显著高于SO组（P＜0.05）。结论:重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织TREM-1表达显著增加,提示TREM-1在重症急性胰腺炎的发生发展过程中存有重要作用,且和其严重程度相关。二、猪重症急性胰腺炎继发感染模型的建立和外周血中TREM-1基因表达的检测目的:构建猪重症急性胰腺炎继发感染模型,分析SAP猪继发感染前后的外周血中TREM-1的表达情况。方法:健康家猪6只,3%戊巴比妥钠静脉麻醉后,采用十二指肠镜下胰管内注射牛磺胆酸钠和胰蛋白酶混合液的方法构建SAP模型。造模后24小时内,胰腺CT检查证实造模成功,并留取外周血。即在CT引导下经穿刺针向胰腺坏死部位注入活化大肠杆菌菌液。7天后复查胰腺CT,观察胰腺实质和局部情况,根据胰腺周围积液情况,选择是否再次由CT引导下注射活化的大肠杆菌标准菌株悬液。SAP造模14天后,处死动物,处死前取外周血5ml。观察猪胰腺组织大体及病理学变化。Real-time PCR相对定量检测SAP猪继发感染前后外周血中TREM-1的mRNA水平表达情况。结果:影象学改变和组织学观察,证实构建猪重症急性胰腺炎继发感染模型成功。抽提外周血中总mRNA,经逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出猪TREM-1产物与预期目的基因长度一致,回收纯化目的产物,测序结果与GenBank公布的基因序列完全一致。Real-time PCR进行相对定量检测,SAP猪继发感染前后外周血中TREM-1的相对表达量分别为1.51±1.38和4.99±3.28,配对t检验结果表明,外周血中TREM-1mRNA表达水平继发感染后显著高于单纯SAP时（P＜0.05）。结论:SAP继发感染猪外周血中TREM-1表达显著增加,提示TREM-1参与了SAP发病的全过程。三、TREM-1作为SAP患者继发腹腔感染指标的诊断价值目的:克隆了人TREM-1基因的全长,并探讨SAP患者外周血中TREM-1基因表达情况,判断其对SAP患者继发腹腔感染的诊断价值。方法:收集2006年12月—2007年12月我院消化内科监护室收治的诊断为SAP的患者34例（诊断依据2003年全国胰腺会议确定的急性胰腺炎诊疗指南）,入选患者均为发病1-2周后,排除呼吸道、泌尿系统、皮肤表面感染等,高度怀疑继发腹腔感染的患者,收集外周血5ml。抽提外周血中总mRNA,RT-PCR法扩增出人TREM-1,回收纯化目的产物,测序结果正确。检测血清中C反应蛋白（CRP）,real-time PCR进行相对定量检测各患者外周血中TREM-1的表达情况。收集患者基本临床资料、治疗方式及预后。以腹水、B超/CT引导下囊肿穿刺物的细菌培养结果或外科手术结果为判断SAP继发腹腔感染的标准,将患者分为感染组和未感染组。通过ROC曲线下面积（AUC）检验TREM-1和CRP在预测诊断指标方面的作用,分别计算其判断SAP继发腹腔感染的特异度和敏感度。结果:入选的34例SAP患者,其中男性18例,女性16例（男:女=1.125:1）;平均年龄48.82±18.08岁。其中明确继发腹腔感染12例,无明确腹腔感染的患者22例。死亡2例,转外科手术3例。SAP继发腹腔感染组的TREM-1相对表达量值显著高于非感染组（P＜0.05）。TREM-1的ROC曲线下面积（AUC）为0.795,判断SAP继发腹腔感染的敏感度和特异度分别为83.8%和81.8%。CRP的ROC曲线下面积（AUC）为0.669,判断SAP继发腹腔感染的敏感度和特异度分别为50%和86.4%。结论:SAP患者外周血中TREM-1基因表达情况,对SAP继发腹腔感染的诊断能力高于CRP。有望成为临床上SAP患者监测疾病进展,指导抗生素应用,掌握手术时机的指标。四、TREM1-IgG融合蛋白真核表达载体的构建、表达及鉴定目的:构建人TREM1-IgG融合蛋白及大鼠TREM1-IgG融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中实现稳定表达。方法:克隆人TREM-1胞外区片段,大鼠TREM-1胞外区片段和人IgG1重链基因Fc恒定区。通过T4DNA连接酶三片段连接,获得人及大鼠的pcDNA3.1/TREM1-IgG1重组质粒。采用脂质体法,将两个重组质粒分别转染入CHO细胞并G418筛选,进行稳定表达。收集细胞上清液,Protein A-Sepharose CL-4B免疫亲和纯化,快速获取目的蛋白粗品,SDS-PAGE和Western-Blot对蛋白性质进行初步鉴定。结果:RT-PCR扩增出人TREM-1胞外区、大鼠TREM-1胞外区和人IgG1重链基因Fc恒定区。上述PCR产物与载体pMD-18 T连接后转化大肠杆菌,抽提质粒,酶切测序确认克隆载体构建成功。测序正确的pMD-18 T/人TREM-1胞外区质粒用EcoR和BamHI双酶切,pMD-18 T/大鼠TREM-1胞外区质粒用EcoRI和BamHI双酶切,pMD18T/IgG Fc质粒用BamHI和XhoI双酶切。pcDNA3.1（+）载体质粒分别用EcoR/XhoI和EcoRI/XhoI双酶切。T4DNAligase行三片段连接,分别构建出人及大鼠的TREM1-IgG1Fc/pcDNA3.1（+）重组质粒,测序结果证实序列、启动子、终止子位置及读码框完全正确。两个重组质粒分别应用lipo2000稳定转染CHO细胞,G418以600μg/ml浓度筛选,RT-PCR表明融合基因在稳定转染的CHO细胞上得到了表达。利用Protein A与目的蛋白IgG1Fc段特异性结合的性质,免疫亲和纯化,快速获取目的蛋白粗品。SDS-PAGE可见66KD左右的牛血清白蛋白和39KD左右的目的蛋白两条带。Western Blot结果证明该蛋白样品可被抗人IgG1 Fc抗体特异性识别,证明该蛋白为IgG融合蛋白。结论:成功构建了人TREM1-IgG融合蛋白及大鼠TREM1-IgG融合蛋白真核表达载体,并在CHO细胞中稳定表达。五、大鼠TREM1-IgG融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定目的:构建大鼠TREM1-IgG融合蛋白的原核表达载体,大量表达并纯化鉴定重组大鼠TREM1-IgG融合蛋白。方法:利用EcoRI和XhoI从重组质粒pcDNA3.1/大鼠TREM1-IgG上切下TREM1-IgG1融合基因,插入原核表达载体质粒pGEX-4T-1相应位点,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导重组融合蛋白表达,超声破碎菌体,Glutathione Sepharose 4B洗脱纯化蛋白,测定融合蛋白浓度,SDS-PAGE、Western-Blot和PMF分析蛋白表达情况。结果:重组质粒pcDNA3.1/大鼠TREM1-IgG在EcoRI和XhoI双酶切后,电泳证实切下融合基因TREM1-IgG1,插入原核表达载体质粒pGEX-4T-1相应位点,转化BL21后质粒切出分别对应原质粒和目的基因的两条特异性条带,测序证实为阳性克隆。IPTG诱导并纯化后,SDS-PAGE电泳分析表明在66KD左右出现新的蛋白表达条带,大小与带GST的大鼠TREM1-IgG融合蛋白大小相吻合;Western Blot证实该蛋白为IgG融合蛋白;肽质量指纹谱PMF共测得17个匹配的肽段,证实样品为目的蛋白;纯化后融合蛋白浓度为1mg/ml。结论:成功构建了大鼠TREM1-IgG融合蛋白的原核表达载体,大量表达并纯化出大鼠TREM1-IgG融合蛋白,为进一步研究TREM-1做为SAP分子治疗靶点的价值打下基础。六、融合蛋白TREM1-IgG治疗SAP大鼠的疗效研究目的:观察验证融合蛋白TREM1-IgG对SAP大鼠的疗效。方法:雄性SD大鼠20只,随机分为SAP组、SAP对照蛋白治疗组（GST治疗组）、SAP融合蛋白治疗组（融合蛋白组）、对照组,各5只。采用精氨酸腹腔注射构建SAP大鼠模型,造模成功后3小时,SAP对照蛋白治疗组和SAP融合蛋白治疗组动物分别予以尾静脉注射纯化后的GST蛋白和融合蛋白TREM1-IgG,给药浓度为4mg/kg,SAP组予以500μl生理盐水注射。治疗后24小时处死大鼠,检测血浆淀粉酶、转氨酶及肌酐水平,观察各组大鼠胰腺、肝脏、肺脏组织病理学变化,并对组织损伤评分。结果:TREM1-IgG融合蛋白治疗24小时后,与SAP组和GST蛋白治疗组相比,肌酐及转氨酶的水平无显著性差异,血清淀粉酶有下降趋势。融合蛋白治疗组的胰腺炎症、出血、坏死和肺脏炎症及脏器总损伤的评分,较其它两组,得到显著改善（P＜0.05）。结论:融合蛋白TREM1-IgG能有效缓解SAP大鼠的炎症反应,减轻胰腺、肺脏组织损害。在大鼠体内验证了TREM-1做为SAP分子治疗靶点的价值。通过上述研究,本课题得出以下结论:1.TREM-1参与了重症急性胰腺炎时的“过度”炎症反应,在SAP继发感染时TREM-1的表达显著升高;2.SAP患者外周血中TREM-1的基因表达情况的检测,对SAP继发腹腔感染有较好的诊断能力,具有良好的临床应用前景;3.成功构建了人TREM1-IgG融合蛋白及大鼠TREM1-IgG融合蛋白真核表达载体,并在CHO细胞中稳定表达;4.成功构建了大鼠TREM1-IgG融合蛋白的原核表达载体,大量表达并纯化出大鼠TREM1-IgG融合蛋白;5.融合蛋白TREM1-IgG能有效缓解SAP大鼠的炎症反应,减轻胰腺、肺脏组织损害,动物实验证实了TREM-1做为分子治疗靶点对于SAP的应用价值。小结:该课题揭示了TREM-1在重症急性胰腺炎的发生发展过程中存有重要作用,对SAP继发腹腔感染具有预测诊断价值。构建并表达TREM-1的诱骗受体（大鼠TREM1/人IgG1融合蛋白及人TREM1/人IgG1融合蛋白）,通过干预治疗SAP大鼠,验证了TREM-1做为SAP分子治疗靶点的价值。为SAP患者外周血sTREM-1含量检测在临床的应用,和后续寻找鉴定TREM-1的天然配体,奠定了基础。为SAP发病机制的探讨和综合治疗提供新思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织TREM-1基因表达的检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 猪重症急性胰腺炎继发感染模型的建立和外周血中TREM-1基因表达的检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 TREM-1作为SAP患者继发腹腔感染指标的诊断价值
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 TREM1-IgG融合蛋白真核表达载体的构建、表达及鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第五部分 大鼠TREM1-IgG融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第六部分 融合蛋白TREM1-IgG治疗SAP大鼠的疗效研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 文献综述
• 参考文献
• 在读期间情况说明
• 致谢