拟南芥rd29A启动子驱动的BADH基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

论文摘要

转基因作物的成功应用在很大程度上取决于导入基因的表达水平,外源基因在转基因植物中的表达最终由启动子来控制。对启动子的研究,一直是植物基因工程的热点。本试验针对rd29A基因启动子的表达调控,主要研究结果如下:1.本研究通过引物设计以及人工设计合成的HindⅢ与BamHⅠ酶切位点,从拟南芥（Arabidopsis thaliana）植物中提取基因组DNA,成功克隆了诱导型启动子rd29A基因（907 bp）,rd29A基因启动子片段与GenBank中已注册的序列（序列号:D13044）同源性为94.61%,虽有少数碱基的突变或缺失,但突变或缺失均未发生在启动子序列的关键调控活性位点,对其活性不会产生任何影响。序列分析表明该启动子具有两个干旱、高盐和低温响应顺式作用元件（DRE）,TATAbox存在于474bp～479bp处,在第597bp～601bp之间有一个CAATbox（CCAAT）,在第659bp～666bp之间和第714bp～721bp之间各有一个干旱、高盐和低温响应（DRE）顺式作用元件,DRE序列含有9个碱基（TACCGACAT）。2.通过用限制性内切酶HindⅢ与BamHⅠ分别双酶切质粒pGEMT-rd29A和双元载体pBI101.2,回收907bp的启动子片段和pBI101.2线状载体,回收的启动子基因片段与线状载体的粘性接头恰好匹配,经过连接,转化和菌落筛选鉴定,成功构建了带有卡那抗性的植物表达载体pBI-rd29A-GUS。3.通过用限制性内切酶HindⅢ与BamHⅠ分别双酶切质粒pGEMT-rd29A和植物表达载体pBI-BADH,回收907bp的启动子片段和pBI-BADH线状载体,回收的启动子基因片段与线状载体的粘性接头恰好匹配,经过连接,转化和菌落抗性筛选鉴定,证明启动子已与耐盐BADH基因连接,成功构建了pBI-rd29A- BADH。4.利用冻融法将构建好的植物表达载体pBI-rd29A-GUS直接导入根癌农杆菌EHA105中,用抗生素抗性筛选和PCR检测鉴定pBI-rd29A-GUS已导入农杆菌。再采用根癌农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 启动子研究进展
• 1.1 组成型启动子
• 1.2 组织特异性启动子
• 2 诱导型启动子
• 2.1 物理因素诱导表达的启动子
• 2.2 化学因素诱导表达的启动子
• 2.3 激素诱导表达启动子
• 2.4 创伤诱导表达启动子
• 2.5 真菌诱导启动子
• 2.6 低温、干旱和盐胁迫诱导启动子
• 3 rd29A 功能
• 3.1 胁迫基因功能
• 3.2 胁迫诱导基因的调控与表达
• 4 本研究的目的和意义
• 5 试验技术路线
• 第二章 rd29A 启动子的克隆
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 工具酶和试剂
• 2 方法
• 2.1 拟南芥基因组DNA 的提取
• 2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3 PCR 扩增及回收
• 2.4 PCR 产物的连接
• 2.5 连接产物的转化
• 2.6 重组质粒的篮白斑筛选
• 2.7 重组质粒的酶切和PCR 鉴定
• 2.8 DNA 序列测定及序列比较分析
• 3 结果与分析
• 3.1 拟南芥提取DNA 的电泳检测
• 3.2 rd29A 启动子PCR 扩增及回收
• 3.3 rd29A 启动子重组子蓝白斑筛选
• 3.4 重组质粒的PCR 鉴定
• 3.5 重组质粒的酶切鉴定
• 3.6 重组质粒测序结果与分析
• 4 讨论
• 4.1 测序结果
• 4.2 rd29A 基因
• 第三章 植物表达载体构建
• 1 材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 工具酶和试剂
• 2 方法
• 2.1 构建植物表达载体pBI-rd29A-GUS
• 2.2 构建植物表达载体pBI-rd29A-BADH
• 3 结果与分析
• 3.1 构建植物表达载体pBI-rd29A-GUS
• 3.2 构建植物表达载体pBI-rd29A-BADH
• 4 讨论
• 4.1 启动子及其对基因表达的调控
• 4.2 影响酶切和连接的因素
• 4.3 载体构建
• 第四章 植物表达载体转化烟草
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株
• 1.3 试剂
• 2 方法
• 2.1 提取质粒DNA
• 2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.3 植物表达载体导入农杆菌感受态细胞
• 2.4 转化菌的鉴定
• 2.5 工程菌转化烟草
• 2.6 转基因植株检测
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体转化农杆菌结果
• 3.2 PCR 检测
• 3.3 转化烟草
• 4 讨论
• 4.1 工程菌的鉴定
• 4.2 烟草转化
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介