论文摘要
粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）是一种分泌性多肽,具有174个氨基酸,分子量大约是18kD。它最初是从癌细胞中分离得到,它的基因通过基因工程技术已经在不同宿主细胞中被克隆、测序、表达。G-CSF能刺激骨髓干细胞分化、增殖,形成粒细胞。G-CSF能启动机体保护机制抗感染,主要是通过提高多形核中性白细胞和它们的分化成熟形细胞数量。G-CSF能激活人体的预防功能,在不同的病态环境下如中性粒细胞异常偏低或免疫系统低下。例如,在癌症化疗后,移植特别是骨髓移植或者在白细胞减少情况下G-CSF都可起到作用。但是,G-CSF存在给药后会被快速降解,半衰期短的缺陷。G-CSF的这种性质对于提高其生物效能是一个障碍。为了延长G-CSF在体内作用的半衰期,本研究设计了一种G-CSF与人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）的融合蛋白。HSA是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质,分子质量为66.5 kD。作为血浆的重要成分之一,HSA是许多内源因子和外源药物的载体,正常情况下不易透过肾小球。在血浆中的半衰期长达2周,体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性,因而是一种理想的生物活性蛋白载体。通过基因工程技术将HSA基因与G-CSF基因相连接,使G-CSF在不丧失生物活性的情况下,在血浆中的半衰期能够得到显著地延长。从而,HSA-G-CSF融合蛋白就可降低给药频率和剂量,却能发挥出与G-CSF相似的药效作用,具有较好的应用前景,并为进一步研究蛋白类药物的长效性提供依据。1.pPIC9-HSA-G-CSF重组质粒的构建及鉴定用PCR法从人胎肝cDNA文库获得3’端带有连接肽（Gly Gly Gly Gly Ser）的血清白蛋白基因,长度大约为1.8kb,再将PCR产物克隆入pGEM-T载体中。用PCR的方法从人胎肝cDNA文库获得G-CSF基因,并将其克隆入pUC19质粒中。将人血清白蛋白基因的3’端通过柔性接头（GGGGS）与G-CSF的5’端相连接,并克隆至pPIC9载体中。用Sal I、Xho I、BamH I、EcoR I酶切鉴定重组质粒,证明已成功构建。2.毕赤酵母转化及转化子甲醇利用表型鉴定制作毕赤酵母GS115感受态细胞,用电转化法将Sal I酶切线性化的pPIC9-HSA-G-CSF转化至GS115中。转化后铺于不含组氨酸的RDB平板,30℃培养2天后长出一些毕赤酵母转化子。点种至MM板和MD板进行甲醇利用表型筛选,其中Mut+型转化子约占总转化子的90%,MutS型转化子约占总转化子的10%。3.毕赤酵母转化子PCR法鉴定以重组酵母的基因组为模板,用5’-AOX1和3’-AOX1为引物进行PCR检测,电泳在2.2kb、2.4kb处各有一明显条带。结果显示HSA-G-CSF表达盒已经成功的整合至酵母基因组中。4.毕赤酵母转化子摇瓶诱导表达随机挑选的几个毕赤酵母转化子,用摇瓶、30℃、以250r/min转速振荡培养,经3%甲醇诱导表达120h,电泳鉴定在86kDa处都出现了目标条带。选取转化子进行发酵培养,取诱导培养的12h,24h,48h,72h,96h,120h发酵液,离心取上清进行SDS-PAGE分析。电泳鉴定发现随着诱导时间的延长,培养基中的分泌蛋白的量增多,在诱导72h时表达量最高,发酵液中HSA-G-CSF融合蛋白的浓度约为450mg/L。5.HSA-G-CSF融合蛋白的纯化取摇瓶诱导表达72h的发酵液上清,经亲和柱、疏水柱、离子交换柱、凝胶柱纯化后得到较纯的HSA-G-CSF融合蛋白。经反相HPLC检测其纯度大于97%。6.Western blotting免疫印迹分析免疫印迹分析发现凝胶电泳中的86kDa条带既能与兔抗HSA抗血清,也能与兔抗G-CSF多克隆抗体之间发生特异性结合。说明融合蛋白同时具有HSA和G-CSF抗原性。免疫印迹的结果验证了融合蛋白中存在HSA和G-CSF两个部分。7.HSA-G-CSF融合蛋白的结构鉴定通过等电聚焦、N-端和C-端氨基酸测序、质谱分析及圆二色谱分析,证实HSA-G-CSF融合蛋白具有正确的HSA和G-CSF氨基酸序列。8.HSA-G-CSF的生物学活性按中国药典的方法测定HSA-G-CSF对NFS-60细胞的增殖作用来确定HSA-G-CSF的生物学活性。生物学活性测定结果表明本研究表达的HSA-G-CSF具有与G-CSF相似的活性,能使NFS-60细胞增殖,并且作用呈剂量依赖性。9.HSA-G-CSF的药代动力学对小鼠进行皮下注射,在不同时间点取血,用ELISA方法对血样进行检测,通过统计学方法得到HSA-G-CSF的药代动力学参数:半衰期、清除率分别为10.6h、15ml/h/kg,是G-CSF的5倍与1/8倍。证实HSA-G-CSF融合蛋白具有长效性。综上所述:经过western blotting、等电聚焦、氨基酸测序、质谱分析及圆二色谱分析等方法证实毕赤酵母表达的HSA-G-CSF融合蛋白具有正确的HSA和G-CSF结构;NFS-60细胞增殖实验证明HSA-G-CSF融合蛋白具有与G-CSF相同的生物学活性;小鼠的药代动力学实验显示HSA-G-CSF融合蛋白延长了G-CSF在体内作用的半衰期,降低了清除率,从而证实HSA-G-CSF融合蛋白具有长效性。