论文摘要
目的：探讨MAPK家族P38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和c-Jun氨基端激酶（JNK）信号通道在TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞上皮-间质转分化（EMT）中的意义,以及沙利度胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞的EMT的作用以及对MAPK家族成员JNK、P38MAPK的影响,从而进一步揭示肺纤维化的发病机制,阐明沙利度胺抗肺纤维化的机理,为肺纤维化的治疗寻找新的切入点。方法：第一部分A549细胞在含TGF-β1（3ng/ml）的培养基培养48小时,从而诱导A549细胞上皮间质细胞转分化（EMT）; JNK特异抑制物（SP-600125）预处理1小时,P38MAPK特异抑制物（SB-203580）预处理1小时,然后在含3ng/ml TGF-β1培养基培养48小时；基因沉默组在shRNA转染成功后在含3ng/ml TGF-β1培养基培养48小时。磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA检测在TGF-β1处理30min后进行,细胞形态评估、细胞标志蛋白以及mRNA的检测在TGF-β1培养基培养48小时后进行。所有组做A549细胞形态评估,并通过免疫印迹法（western blotting）检测A549细胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及间质细胞表型蛋白包括结蛋白（desmin）、波形蛋白（vimentin）、α-肌动蛋白（a-SMA）和上皮细胞表型蛋白包括E-钙粘素（E-cadherin）、紧密连接蛋白（zonula occludens-1,ZO-1）、水通道蛋白-5（aquaporin-5,AQP-5）的表达。基因沉默组还需通过实时荧光定量PCR方法检测A549细胞的P38MAPK和JNK的mRNA.第二部分沙利度胺溶解于二甲基亚砜（DMSO）,A549细胞分为3组：A：对照组；B:TGF-pl+DMSO组（DMSO提前预处理24小时,然后给予TGF-β1）; C: TGF-β1+沙利度胺组（沙利度胺含量为10μg/ml,提前预处理24小时,然后给予TGF-β1）；TGF-β1含量为3ng/ml,孵育48h,磷酸化的p38MAPK、JNK蛋白和mRNA检测在TGF-β1处理30min后进行,细胞形态评估和细胞标志蛋白的检测在含TGF-β1培养基培养48小时后进行。所有组行A549细胞形态评估,并通过免疫印迹法（western blotting）检测A549细胞磷酸化p38MAPK和JNK的蛋白,以及间质细胞表型蛋白包括desmin、vimentin、α-SMA和上皮细胞表型蛋白包括E-cadherin、ZO-1、AQP-5的表达。结果：第一部分A549细胞在TGF-β1诱导48小时后表现出类成纤维细胞表型,细胞间连接减少。TGF-β1显著减少肺泡上皮细胞的上皮标志物E-钙粘素、ZO-1和AQP-5的表达（p<0.05）,与此对应的是增加成纤维细胞标志物α-SMA、desmin和vimentin的表达（p<0.05）。TGF-β1显著增加A549细胞磷酸化的p38MAPK和磷酸化的JNK蛋白的表达（p<0.05）;JNK的特异抑制剂SP-600125和p38MAPK特异抑制剂SB-203580,均可以抑制A549细胞向间质细胞转分化,显著抑制（p<0.05）TGF-β1诱导的A549细胞α-SMA、结蛋白和波形蛋白表达,与此对应的是可阻止（p<0.05） TGF-β1诱导的A549细胞E-钙粘素、ZO-1和AQP-5减少,显著减少活性MAPK蛋白（磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK）的表达（p<0.05）;p38MAPK和JNK基因沉默均可以抑制A549细胞向间质细胞转分化,可以显著抑制TGF-β1诱导的A549细胞α-SMA、结蛋白和波形蛋白表达（p<0.05）,与此对应的是可阻止TGF-β1诱导的A549细胞E-钙粘素、ZO-1和AQP-5减少（p<0.05）,可以显著减少p38MAPK和JNK mRNA和蛋白表达（p<0.05）第二部分沙利度胺可以抑制TGF-β1诱导A549细胞向间质细胞转分化,显著抑制（p<0.05） TGF-β1诱导的A549细胞α-SMA、结蛋白和波形蛋白表达,与此对应的是可阻止（p<0.05）TGF-β1诱导的A549细胞E-钙粘素、ZO-1和AQP-5减少,显著减少活性MAPK蛋白（磷酸化的JNK和磷酸化的p38MAPK）的表达（p<0.05）。结论：1.TGF-β1可诱导A549细胞向间质细胞转分化；2. p38MAPK和JNK信号通道在TGF-β1诱导的A549细胞上皮-间质转分化过程起重要作用；3.沙利度胺可能通过抑制p38MAPK和JNK信号通道,从而抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转分化过程而发挥抗纤维化作用。
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