荧光假单胞菌的分离及蝎毒基因的原核表达

论文摘要

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是植物内生菌和植物根际微生物,它有促进植物根际生长、生物防治双重功能。北非蝎昆虫毒素AaHIT1（Androctonus australis Hector insect toxin,AaHIT）是神经毒素,能专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小,在开发新型生物杀虫剂的领域里有着诱人的前景。从上海周边的宝山、奉贤、浦东等地区采集植物根际土壤,用KB培养基分离出产荧光的菌株,经过形态观察和生化鉴定,筛选出其中的荧光假单胞菌,利用这些荧光假单胞菌与农作物病原微生物通过菌斑抑制法,从中分离到有抑制病原菌作用的菌株。大量实验和文献证明,荧光假单胞菌是良好的基因工程菌的受体菌,所以,本实验将蝎昆虫毒素AaHIT1 基因转入分离得到的荧光假单胞菌中,使AaHIT1 基因能在原核系统中表达。首先,根据AaHIT1的氨基酸序列以及原核微生物对密码子的偏好,设计DNA 的编码序列。由于设计出的AaHIT1 基因将要在大肠杆菌中试表达,所以,设计DNA 序列时,要考虑大肠杆菌对密码子的偏好。其次,依据AaHIT1 的DNA 序列设计互补的8条引物,在退火、延伸的温度下,8 条引物相互拼接,经测序鉴定形成了与预先设计的AaHIT1 基因序列一致的DNA 序列。将AaHIT1 的编码序列与pET32a载体连接,构建pET32a/ AaHIT1 重组质粒,在E. coli Bl21 中进行试表达。表达成功后,将AaHIT1 的编码序列克隆到多宿主表达载体pSUP106 中,形成pSUP106/ AaHIT1 重组载体,将其导入到有抑菌作用的荧光假单胞菌中,表达产物经SDS-聚丙烯酰胺电泳检测,结果证明北非蝎昆虫毒素AaHIT1 已在荧光假单胞菌中表达。进一步表明,为研制“双价”环境友好型基因工程荧光假单胞菌奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分:综述
• 第一章 荧光假单胞菌和蝎昆虫毒素的植物保护作用
• 1 荧光假单胞菌抑制植物病害与促进植物生长的机制
• 1.1 荧光假单胞菌的生物活性物质能抑制植物病原菌
• 1.2 荧光假单胞菌高密度的分布能控制植物病害
• 1.3 荧光假单胞菌的物质转化功能可改善植物营养
• 1.4 荧光假单胞菌的分解作用能消除根际土壤的有毒物质
• 1.5 荧光假单胞菌在植物体内外的定植能诱导系统抗性作用
• 2 荧光假单胞菌工程菌的构建与植保作用增强的研究
• 2.1 荧光假单胞菌作为工程菌的优势
• 2.2 导入外源基因提高荧光假单胞菌保护植物的能力
• 2.3 导入外源基因增加假单胞菌治理环境、清除污染的能力
• 3 可用于植物保护的蝎毒及其编码基因的重组与表达
• 3.1 蝎毒的种类
• 3.2 北非蝎的昆虫毒素
• 3.3 蝎昆虫毒素的结构及其编码基因
• 3.4 蝎毒的作用
• 3.5 蝎昆虫神经毒素基因的表达与重组
• 第二部分:研究论文
• 第二章 荧光假单胞菌的分离及鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 仪器与设备
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 试剂
• 2 方法
• 2.1 菌种的采集和筛选
• 2.2 形态观察
• 1)鞭毛染色与显微观察
• 2)超显微观察
• 2.3 生化鉴定
• 1)革兰氏染色
• 2)明胶液化
• 3)接触酶
• 4)柠檬酸盐利用
• 5)淀粉水解
• 6)反硝化
• 7)脂酶
• 8)糖发酵
• 9)运动性分析
• 2.4 致病菌拮抗实验
• 2.5 分子生物学检测
• 2.5.1 基因组DNA 的抽提
• 2.5.2 PCR 扩增
• 2.5.3 电泳产物的回收
• 2.5.4 连接反应
• 2.5.5 感受态细胞的制备
• 2.5.6 转化
• 2.5.7 质粒鉴定
• 2.5.8 测序
• 结果与讨论
• 1 菌种的筛选
• 2 形态特征的观察
• 3 生化鉴定
• 4 致病菌拮抗实验
• 5 X21022 和X21023 菌株phlD 基因的检测结果
• 第三章 蝎毒素基因的原核表达
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 仪器与设备
• 1.2 实验材料
• 1.3 培养基成分
• 1.4 试剂
• 2 方法
• 2.1 毒蛋白基因AaHIT1 的合成
• 2.1.1 毒蛋白基因AaHIT1 的设计
• 2.1.2 测序载体pMD18-T/ AaHIT1 的构建
• 2.2 原核表达系统pET32a/AaHIT1 的构建
• 2.3 AaHIT1 的诱导表达
• 2.4 诱导产物活性的鉴定
• 2.5 AaHIT1 在荧光假单胞菌原核表达体系中的表达
• 2.5.1 pSUP106/ AaHIT1 的构建
• 2.5.2 pSUP106/ AaHIT1 转化荧光假单胞菌X21022
• 2.5.3 带有pSUP106/ AaHIT1 质粒的荧光假单胞菌的表达
• 结果与讨论
• 1 毒蛋白基因AaHIT1 的合成
• 1.1 毒蛋白基因AaHIT1 的设计
• 1.2 测序载体的构建及测序结果
• 2 原核表达载体的构建
• 3 AaHIT1 的诱导表达
• 4 表达产物活性的测定——甜菜夜蛾的生物测定
• 5 AaHIT1 在荧光假单胞菌原核表达体系中的表达
• 5.1 pSUP106/AaHIT1 的构建
• 5.2 pSUP106/AaHIT1 转化荧光假单胞菌 X21022
• 5.3 表达转化有pSUP106/ AaHIT1 质粒的荧光假单胞菌 X21022
• 参考文献
• 致谢
• 附录