氟致体外培养牛脾脏淋巴细胞凋亡机理的研究

论文摘要

氟过量摄入可引起机体多器官、多功能的损害,表现为以骨骼改变为主的全身性疾病。在非骨相损害中,氟的免疫毒性日渐受到重视。本课题以体外培养牛脾脏淋巴细胞为研究对象,在培养液中加入不同浓度氟化钠（NaF）,通过对牛脾脏淋巴细胞活性、细胞凋亡、抗氧化功能、DNA损伤、细胞内游离Ca2+浓度、Caspase-3与Caspase-9活性及CaM、Caspase-3 mRNA表达水平的检测,旨在探讨氟致牛脾脏淋巴细胞凋亡的机制。研究结果表明:1.应用台盼蓝拒染试验、四唑盐比色法（MTT）、二硝基苯肼比色法检测了牛脾脏淋巴细胞的活性和培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性。结果表明,氟对牛脾脏淋巴细胞的半数抑制浓度（IC50）为1134.32μmol/L,氟能够抑制体外培养牛脾脏淋巴细胞的活性,并对牛脾脏淋巴细胞具有毒性作用。2.对染氟牛脾脏淋巴细胞内一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量及一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）与谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的检测。结果表明,氟能够引发牛脾脏淋巴细胞内氧化胁迫,对免疫细胞具有毒性作用。3.用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色荧光显微镜下、倒置显微镜下观察不同浓度NaF诱导牛脾脏淋巴细胞凋亡的形态学变化及细胞生长情况。结果表明,氟能够诱导牛脾脏淋巴细胞凋亡,且凋亡率具有剂量依赖性。4.应用琼脂糖凝胶电泳、KCl-SDS沉淀法检测氟对牛脾脏淋巴细胞DNA的损伤作用。结果表明,氟能够引发淋巴细胞DNA损伤,并呈现剂量效应。5.应用流式细胞术检测牛脾脏淋巴细胞Δψm变化。结果表明,氟可通过引起牛脾脏淋巴细胞Δψm降低而诱导细胞凋亡。6.应用半定量RT-PCR法和荧光探针法检测细胞内CaM mRNA表达水平和游离Ca2+浓度。结果表明,氟能够引起牛脾脏淋巴细胞内CaM mRNA表达水平下降,游离Ca2+浓度升高,干扰细胞Ca2+的转运,导致细胞钙稳态失衡而诱导细胞凋亡。7.应用半定量RT-PCR方法检测细胞Caspase-3 mRNA表达水平,比色检测Caspase-3、Caspase-9活性。结果表明,牛脾脏淋巴细胞内Caspase-3 mRNA表达及Caspase-3、Caspase-9活性增加是氟引起牛脾脏淋巴细胞凋亡的关键因素。本研究以体外培养染氟牛脾脏淋巴细胞为研究对象,从细胞的形态、DNA损伤、酶活性及凋亡基因表达水平等角度入手,从分子水平上揭示了氟免疫毒性机制。该研究结果可为揭示氟致动物免疫细胞损伤和免疫毒性机制提供科学的理论基础和试验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 地氟病的研究简史
• 1.2 氟的生物学效应
• 1.3 氟免疫毒性的研究进展
• 1.3.1 氟对免疫器官的影响
• 1.3.2 氟对细胞免疫的影响
• 1.3.3 氟对体液免疫的影响
• 1.3.4 氟对细胞因子的影响
• 1.4 氟毒性机制的研究进展
• 1.4.1 氟与氧化损伤
• 1.4.2 氟与DNA 损伤
• 1.4.3 氟与基因表达
• 1.5 试验目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验主要仪器与试剂
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 牛脾脏淋巴细胞的制备、培养及处理
• 2.3 检测项目与方法
• 50)的检测'>2.3.1 牛脾脏淋巴细胞活性及细胞半数抑制浓度(IC₅₀)的检测
• 2.3.2 牛脾脏淋巴细胞凋亡的形态学观察
• 2.3.3 牛脾脏淋巴细胞内NO 代谢的检测
• 2.3.4 牛脾脏淋巴细胞内抗氧化功能的检测
• 2.3.5 牛脾脏淋巴细胞DNA 损伤的检测
• 2.3.6 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（Δψm）
• 2.3.7 Caspase-3 和Caspase-9 活性的检测
• 2+]i 的检测'>2.3.8 牛脾脏淋巴细胞内[Ca²⁺]i 的检测
• 2.3.9 半定量RT-PCR 法测定牛脾脏淋巴细胞内CaM、Caspase-3 mRNA 的表达
• 2.4 试验数据的分析与统计
• 3 结果与分析
• 50)检测结果'>3.1 牛脾脏淋巴细胞活性及细胞半数抑制浓度(IC₅₀)检测结果
• 50 检测结果'>3.1.1 台盼蓝排斥实验及MTT 法检测细胞活性和IC₅₀检测结果
• 3.1.2 牛脾脏淋巴细胞培养上清液中LDH 活性的检测结果
• 3.2 牛脾脏淋巴细胞凋亡的形态学观察检测结果
• 3.2.1 倒置显微镜观察细胞凋亡形态结果
• 3.2.2 AO/EB 双荧光染色检测结果
• 3.3 牛脾脏淋巴细胞内NO 代谢的检测结果
• 3.3.1 牛脾脏淋巴细胞内NO 含量的检测结果
• 3.3.2 牛脾脏淋巴细胞内NOS 活性的检测结果
• 3.4 牛脾脏淋巴细胞内抗氧化功能的检测结果
• 3.4.1 牛脾脏淋巴细胞内GSH-Px 活性的检测结果
• 3.4.2 牛脾脏淋巴细胞内SOD 活性的检测结果
• 3.4.3 牛脾脏淋巴细胞内MDA 含量的检测结果
• 3.5 牛脾脏淋巴细胞DNA 损伤的检测结果
• 3.5.1 DNA Ladder 检测结果
• 3.5.2 DPC 系数的检测结果
• 3.6 牛脾脏淋巴细胞ΔΨM 变化的检测结果
• 3.7 牛脾脏淋巴细胞CASPASE-3 和CASPASE-9 活性的检测结果
• 3.7.1 牛脾脏淋巴细胞Caspase-3 活性的检测结果
• 3.7.2 牛脾脏淋巴细胞Caspase-9 活性的检测结果
• 2+]I 的检测结果'>3.8 牛脾脏淋巴细胞内[Ca²⁺]I 的检测结果
• 3.9 半定量RT-PCR 法测定牛脾脏淋巴细胞内CAM、CASPASE-3 MRNA 的表达的检测结果
• 3.9.1 牛脾脏淋巴细胞内总RNA 提取的结果
• 3.9.2 牛脾脏淋巴细胞β-actin、CaM 与Caspase-3 基因片段的克隆
• 3.9.3 牛脾脏淋巴细胞内CaM mRNA 表达的检测结果
• 3.9.4 牛脾脏淋巴细胞内Caspase-3 mRNA 表达的检测结果
• 4 讨论
• 50 及淋巴细胞活性的影响'>4.1 氟对牛脾脏淋巴细胞IC₅₀及淋巴细胞活性的影响
• 50 的影响'>4.1.1 氟对牛脾脏淋巴细胞IC₅₀的影响
• 4.1.2 氟对牛脾脏淋巴细胞上清液中LDH 活性的影响
• 4.2 氟对牛脾脏淋巴细胞凋亡的影响
• 4.2.1 氟对牛脾脏淋巴细胞的形态影响
• 4.2.2 氟对牛脾脏淋巴细胞DNA 断裂的影响
• 4.3 氟致牛脾脏淋巴细胞凋亡机制
• 4.3.1 氟对牛脾脏淋巴细胞内抗氧化功能及NO 代谢的影响
• 4.3.2 氟对牛脾脏淋巴细胞Δψm 的影响
• 4.3.3 氟对牛脾脏淋巴细胞内钙稳态的影响
• 4.3.4 氟对牛脾脏淋巴细胞内 Caspase-3 mRNA 表达及 Caspase-3、Caspase-9活性的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文