脉动生物反应器的研制、测试和初步试用

论文摘要

心脏瓣膜病是危害人类健康的重要疾病,人工心脏瓣膜置换术是心脏瓣膜病的重要治疗方法。临床上目前使用的人造心脏瓣膜主要有机械瓣和生物瓣,但都有其各自的缺点,机械瓣存在要终生抗凝、潜在性的出血、血栓形成、栓塞等问题;生物瓣则易钙化、变性以致衰败失去功能。组织工程心脏瓣膜是利用有生物活性的细胞种植于支架材料之上,使得该瓣膜在植入人体后仍能保持生物活性,能随机体的发育而生长,较现有的机械瓣和生物瓣更加理想。随着组织工程心脏瓣膜的研究深入,人们发现体外构建的组织工程心脏瓣膜在置入人体内无法经受住体内高速血流的冲击,表面的内皮细胞粘附能力差,易脱落。因此体外构建脉动生物反应器,让TEHV在体外脉动流体条件下预适应,从而提高TEHV耐受体内血流冲击的作用。由于目前国内外尚无完善的脉动生物反应器可供使用,都处于实验阶段。因此,本研究自行研制脉动生物反应器。并进行了相关的测试。然后,将内皮祖细胞和去细胞猪主动脉瓣膜构建的组织工程心脏瓣叶（THEV）置入脉动生物反应器中进行预适应,观察瓣叶表面细胞的生长情况,探讨脉动生物反应器在TEHV构建中的应用。第一部分:脉动生物反应器的构建和性能测试（1）脉动生物反应器的构建包括两个部分:动力部分和流体培养部分。动力部分是有我们自行构建的能够周期性的排出和吸入空气的动力装置。流体培养部分是由几部分组成,心室辅助装置:连接动力部分与流体培养部分。瓣膜培养腔:由聚碳酸酯合成的管状培养腔,中问的瓣架可以固定瓣膜。还有储液罐,也由聚碳酸酯材料制成,各个部分由医用硅胶管道连接而成。整个流体培养部分置入细胞培养箱,处于37℃,含5%CO2和95%空气的培养环境中。（2）脉动生物反应器性能测试①机械稳定性的测试利用普通生物瓣做试验瓣膜,连续运转5天,观察脉动生物反应器的机械稳定性,共检测3次。观察各个连接部位对合是否紧密,是否漏液。观察能否产生搏动性液体,瓣膜能否具有正常的开闭功能。②抗污染性能检测:采用LB培养基做灌注液,连续运转5天,观察培养液有无混浊,共检测3次。光镜观察LB培养基有无细菌或霉菌污染,同时行营养琼脂培养基和霉菌琼脂培养基涂板试验。③构建材料的细胞毒性试验:用构建瓣膜培养腔和储液罐的聚碳酸酯材料浸提液、医用硅胶管道的浸提液与人脐静脉内皮细胞共培养,通过计数细胞的相对增值率（MTT法检测）来判断材料的体外细胞毒性分级。以检测材料能否作为构建培养细胞脉动生物反应器而被安全使用。④流体力学性能检测:以生物瓣做试验瓣膜,运行脉动生物反应器,进行流体力学性能检测。在不同工作状况下,测试脉动生物反应器的流量,通过压力传感器测脉动反应器内通过生物瓣液体的压力。结果:（1）构建的脉动生物反应器性能动力系统:自行研制的脉动生物反应器动力装置,工作稳定,收缩压0-250mmHg,舒张压-100-100mmHg。输出心率0-90次/分。流体培养系统:瓣膜培养腔可以较好的固定瓣膜。储液瓶容积1000ml左右,可以满足储液要求。（2）采用生理盐水做灌注液,脉动反应器连续运转5天,检测3次,未有液体渗漏,机械状态稳定,未见异常。大体观察见可产生搏动性液体,随动力装置调节压力和流量也随之变化。生物瓣具有正常的开、闭功能,瓣叶活动自如。用LB培养基灌注液运转5天,检测3次,未见培养液混浊,光镜观察未见细菌和霉菌污染。营养琼脂培养基和霉菌琼脂培养基涂板试验阴性。采用构建脉动生物反应器的材料浸提液与人脐静脉内皮细胞体外共培养,相对增值率均大于95%,结果证明材料对细胞毒性为1级,毒性较低,可用于细胞的体外培养。流体力学性能检测可见脉动生物反应器能够产生搏动性液体,流量0-3500ml/min,压力0.120mmHg,频率0-90次/分。流体力学参数说明其能够模拟体内心脏瓣膜的流体力学特性。第二部分.脉动生物反应器在TEHV构建中的初步试用（1）外周血内皮祖细胞的培养和鉴定（2）采用胰酶、去污剂Triton-X100、核酸酶进行猪主动脉瓣膜的脱细胞处理,通过组织切片、扫描电镜检查观察脱细胞效果。（3）采用去细胞猪主动脉瓣叶做支架材料,人外周血内皮祖细胞做种子细胞,体外静态构建TEHV。于构建的第7天通过瓣叶组织切片、免疫细胞染色、扫描电镜等观察内皮祖细胞的生长状态。（4）静态构建的TEHV前体在脉动生物反应器中的初步应用。实验随机分3组,每组6个瓣叶。静态对照组:静态构建的TEHV,未经过流体作用;高流量培养组:静态构建的TEHV置入反应器内,直接给予1500ml/min培养。脉动流预适应组:静态构建的TEHV置入反应器内,起始流量100ml/min,以200ml/d的速度增加流量,培养8日至1500ml/min。于第8日剪取瓣叶行HE染色、扫描电镜观察细胞在瓣叶上的生长状态。结果:成功培养出外周血内皮祖细胞,且生长状况良好。采用已有去细胞方法可完全去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,且胶原纤维保存完好,扫描电镜见去细胞瓣膜表面细胞去除干净。构建的组织工程瓣膜,光镜下观察,可见瓣叶表面有内皮细胞紧贴表面生长,在瓣叶纤维层面,内皮细胞顺着凹凸不平的表面基本形成一层连续细胞层,但细胞并未向瓣叶基质内部长入,免疫组化和免疫荧光染色见去细胞瓣叶的表面细胞层着色。脉动流培养后,见经过脉动流预适应组残留的细胞要明显多于直接高流量培养组（0.132±0.013 vs0.648±0.036,P＜0.05）,且细胞之间,细胞与支架之间连接紧密。结论:自行设计的脉动反应器动力装置压力和频率基本上能够满足需求。流体培养系统运行稳定,瓣膜固定方便,总体来说,成功构建了可以初步使用的脉动生物反应器。脉动生物反应器能够模拟在体心脏瓣膜的流体力学特征,产生搏动性液体,具有较好的机械稳定性和抗污染性能;构建材料细胞毒性很低,可用于细胞培养的试验研究。外周血内皮祖细胞在去细胞猪主动脉瓣上生长良好,可以作为构建TEHV的种子细胞。将种植内皮祖细胞的去细胞猪瓣叶置入脉动生物反应器中进行研究,当经过脉动应力预适应处理后,瓣叶表面残留的细胞要明显多于未经预适应处理组,且细胞细胞之间、细胞和支架之间连接比较紧密。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 脉动生物反应器的构建和性能检测
• 1 材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 常用溶液的配制
• 2 脉动生物反应器的设计和性能检测
• 2.1 脉动反应器动力装置的设计
• 2.2 脉动生物反应器培养部分（即脉动生物反应器）设计
• 2.3 性能检测
• 3 结果
• 3.1 脉动反应器动力装置
• 3.2 脉动生物反应器培养部分
• 3.3 性能检测
• 4 讨论
• 实验二 脉动生物反应器在TEHV构建中的初步试用
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 常用溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 外周血内皮祖细胞的获取
• 2.2 去细胞猪瓣的制备及处理
• 2.3 外周血EPCs做种子细胞体外静态种植于支架材料观察
• 2.4 瓣叶上内皮祖细胞生长状况的观察
• 2.5 取材检测
• 2.6 体外脉动流培养后观察
• 3 结果
• 3.1 外周血EPCs的培养和鉴定
• 3.2 猪主动脉瓣的去细胞效果
• 3.3 瓣叶上内皮祖细胞生长状况的观察
• 3.4 构建的TEHV组织学观察
• 3.5 脉动流培养后的观察
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢