灵芝属菌株特异性分子标记的研究

论文摘要

灵芝在我国已有悠久的应用历史,可用于多种疾病的治疗。近年来,灵芝的栽培生产得到迅速发展,灵芝的种质资源也在不断扩大,但是我国的灵芝生产用菌种非常混乱,存在同种异名、同名异种的现象,使得灵芝的基础科研与相关产业的发展面临许多困难。本研究的目的是寻找灵芝属菌株的特异性分子标记,建立灵芝属菌株快速、有效的检测与鉴定方法,为灵芝菌种的鉴定提供一种新的、快速准确而且费用较低的鉴定方法,为我国保护灵芝菌种的知识产权提供有效检测手段及技术标准。本实验以152株灵芝属菌株（包括128株来自中国的栽培菌株及24株国外菌株）为材料,根据本实验室已完成的ERIC-PCR亲缘聚类分析结果,把相似度水平在0.850以上的菌株构成一个DNA池,共建成48个DNA池。用SRAP引物对48个DNA池进行扩增,筛选获得1个SRAP特异性标记;用ISSR引物对48个DNA池进行扩增,筛选获得3个ISSR特异性标记。回收这些特异性条带,经克隆测序后设计了4对SCAR引物,分别为C4A/C4S,C38A/C38S,C39A/C39S,C45A/C45S（C39A/S是通过SRAP获得,另外三个是通过ISSR获得）。通过SCAR-PCR扩增验证,将SRAP标记和ISSR标记均成功的转化为特异性和稳定性更好的SCAR标记。将得到的4个SCAR标记在构成DNA池的152个菌株上验证。为了保证验证的准确性,每次都以特异性菌株为阳性对照,扩增结果显示从C4,C38,C39和C45中获得的特异性SCAR标记在实验所用的所有菌株中扩增都是只对应一个菌株,分别是G0014,G0121,G0142和G0126。说明这四个标记都是针对单一菌株的特异性分子标记。实验结果证实了SCAR特异标记在菌株快速检测鉴定中的可行性和可靠性。在筛选到的4个SCAR标记中,因有两个标记C4（777bp）和C38（774bp）片段大小只相差3bp,在琼脂糖电泳中不能区分,因此我们用筛选到的4个SCAR标记建立了两个多重PCR体系,实现了在同一个反应管内同时可检测和鉴定3个菌株的方法,该体系的建立在实际操作中可大大节省检测时间,同时还可以大大降低实验成本。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 名词缩写
• 一、文献综述
• 1 灵芝概述
• 1.1 灵芝属的分类地位及形态学特征
• 1.2 灵芝的生活史
• 1.3 中国灵芝的种类和自然分布状况
• 1.4 灵芝的化学成分
• 1.5 灵芝的药理活性
• 2 中国灵芝生产的现状
• 3 灵芝属分类鉴定的现状及存在的问题
• 4 灵芝属的鉴定
• 4.1 形态学鉴定
• 4.2 拮抗反应
• 4.3 化学成分分析
• 4.4 同工酶技术
• 4.5 分子标记技术
• 4.5.1 rDNA
• 4.5.2 RAPD
• 4.5.3 AFLP
• 4.5.4 SRAP
• 5 多重PCR
• 6 DNA池（DNA pool）扩增法及其应用状况
• 7 存在的问题与研究目标
• 7.1 已有的工作基础
• 7.2 存在的问题
• 7.3 研究的目标
• 二、材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 1.2.1 PDY液体培养基
• 1.2.2 PDY固体培养基
• 1.2.3 LB液体培养基
• 1.2.4 LB固体培养基
• 1.2.5 LB+AP培养基
• 1.2.6 LB+Ap+IPTG+X-gal平板
• 1.3 供试试剂及配制方法
• 1.3.1 基因组DNA提取试剂
• 1.3.2 电泳缓冲液
• 1.3.3 ITS扩增反应试剂
• 1.3.4 SRAP扩增反应试剂
• 1.3.5 ISSR扩增反应试剂
• 1.3.6 PCR扩增产物的回收纯化
• 1.3.7 PCR产物的分子克隆所用试剂
• 1.3.8 菌株特异性PCR反应试剂
• 1.4 主要使用仪器
• 2 实验方法
• 2.1 菌丝培养及基因组DNA的提取
• 2.2 DNA池的构建
• 2.3 ITS区的PCR扩增
• 2.4 SRAP反应
• 2.5 ISSR反应
• 2.6 PCR扩增产物的纯化及序列测定
• 2.6.1 PCR扩增产物的纯化
• 2.6.2 序列测定和引物设计
• 2.7 SCAR-PCR反应
• 2.8 SCAR分子标记的验证
• 2.8.1 特异性验证
• 2.8.2 灵敏度测试
• 2.8.3 多重PCR的建立
• 三、结果与分析
• 1 DNA模板质量的检验
• 2 DNA池的构建
• 3 菌株特异性分子标记的获得
• 4 SCAR标记的建立
• 4.1 SCAR引物的设计
• 4.2 SCAR扩增结果
• 5 SCAR分子标记的验证
• 5.1 特异性验证
• 5.2 灵敏度测试
• 5.3 多重PCR的建立
• 四、讨论
• 1 DNA池（DNA pool）
• 2 SCAR标记
• 3 形态学鉴定方法与SCAR鉴定方法的比较
• 五、结论
• 参考文献
• 附录
• 附录一 特异性条带的序列
• 附录二 SRAP引物扩增的结果
• 致谢
• 文章发表情况