柳氮磺胺吡啶对肝星状细胞株HSC-T6增殖和凋亡的作用及机制研究

论文摘要

研究背景:肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）凋亡是肝纤维化逆转的重要机制,而肝细胞凋亡是肝纤维化形成的重要促进因素,因此寻找选择性诱导HSCs凋亡的治疗途径对于抗肝纤维化具有非常重要的意义。柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine,SASP）从20世纪40年代由5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid,5-ASA）和磺胺吡啶（sulfapyridine,SPY）通过偶氮键合成了SASP,主要用于治疗溃疡性结肠炎和克隆病。已有研究表明,柳氮磺胺吡啶可选择性诱导多种类型细胞的凋亡,其机制尚不清楚。它对肝星状细胞和正常肝细胞的凋亡有无影响报道甚少。我们以柳氮磺胺吡啶为诱导剂,观察柳氮磺胺吡啶及其分解产物5-氨基水杨酸和磺胺吡啶在体外对正常人肝细胞株（L02细胞）和大鼠肝星形细胞株（HSC-T6细胞）增殖和凋亡的影响,确定其有效的药物成分,并探讨其可能的机制。方法:1、最佳药物浓度与作用时间的筛选:实验分组:柳氮磺胺吡啶作用浓度:0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16mmol/L;作用时间:12、24和48小时。实验方法:CCK-8法检测不同浓度的柳氮磺胺吡啶在不同时间点对HSC-T6增殖的影响。2、柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02增殖和凋亡的影响实验分组:正常对照组;0.1% DMSO对照组;柳氮磺胺吡啶处理组（0.5、1、2 mmol/L）。实验方法:CCK-8法检测柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02增殖的影响;ANNEXINⅤ-FITC/PI双染观察柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02凋亡的影响;AO/EB染色观察细胞凋亡形态。3、诱导HSC-T6凋亡的有效药物成分分析实验分组:正常对照组;0.1%DMSO对照组;柳氮磺胺吡啶处理组（0.5、1、2mmol/L）;5-氨基水杨酸处理组（0.5、1、2mmol/L）;磺胺吡啶处理组（0.5、1、2mmol/L）;5-氨基水杨酸（2mmol/L）+磺胺吡啶（2mmol/L）处理组。实验方法:采用CCK-8法检测各实验组HSC-T6增殖情况;ANNEXINⅤFITC/PI双染检测各实验组HSC-T6凋亡情况。4、柳氮磺胺吡啶选择性诱导HSC-T6凋亡的机制4.1、柳氮磺胺吡啶及其分解产物对IKKα和IκBα磷酸化的影响实验分组:正常对照组;TNF-α处理组（150U/ml）;DMSO+TNF-α处理组;TNF-α+柳氮磺胺吡啶处理组（0.5、1、2mmol/L）;TNF-α+5-氨基水杨酸处理组（2mmol/L）;TNF-α+磺胺吡啶处理组（2mmol/L）。实验方法:Western Blot检测磷酸化IKKα和磷酸化IκBα的表达。4.2、柳氮磺胺吡啶及其分解产物对NF-?B核转位的影响实验分组:正常对照组;TNF-α处理组（150U/ml）;DMSO+TNF-α处理组;TNF-α+柳氮磺胺吡啶处理组（2mmol/L）;TNF-α+5-氨基水杨酸处理组（2mmol/L）;TNF-α+磺胺吡啶处理组（2mmol/L）。实验方法:采用NF-?B分子标记和激光共聚焦显微镜观察NF-?B核转位抑制情况;Western Blot检测细胞核NF-?B P65的表达。结果:1、与对照组比较,在一定浓度范围（0.5、1、2、4、8、16mmol/L）内,柳氮磺胺吡啶对HSC的增殖呈剂量、时间依赖性抑制。柳氮磺胺吡啶在12、24、48小时抑制HSC-T6细胞增殖的50%抑制浓度（IC50）分别为6.53、2.84、1.5mmol/L。结合文献,我们取接近24h的1/3～2/3的IC50浓度（0.5、1、2mmol/L）进行后继实验。2、正常对照组和DMSO对照组的凋亡率分别为1.74±0.31%,3.42±0.41%;柳氮磺胺吡啶（0.5、1、2mmol/L）处理24小时后HSC-T6的凋亡率依次为6.96±0.39%、12.09±1.56%和16.72±2.98%,呈明显的时间和剂量效应,同时伴有晚期凋亡细胞增加。AO/EB染色后,出现凋亡细胞的特征性改变。3、柳氮磺胺吡啶（0.5、1、2 mmol/L）处理L02 24小时后对L02的增殖抑制率和凋亡率与正常对照组和DMSO对照组之间无统计学差异（P>0.05）;AO/EB染色后,未观察到凋亡细胞。4、5-氨基水杨酸和磺胺吡啶（0.5、1、2 mmol/L）处理HSC-T6 24小时后,HSC-T6的增殖抑制率和凋亡率与正常对照组和DMSO对照组之间无统计学差异（P>0.05）。5、柳氮磺胺吡啶处理组（0.5、1、2mmol/L）磷酸化IKKα、I?Bα较DMSO+TNF-α处理组逐渐减弱;而5-氨基水杨酸（2mmol/L）和磺胺吡啶（2mmol/L）处理组磷酸化IKKα、I?Bα与DMSO+TNF-α处理组之间无统计学差异（P>0.05）。6、柳氮磺胺吡啶处理组（2mmol/L）细胞核NF-?B P65的表达较TNF-α处理组明显减弱;而5-氨基水杨酸（2 mmol/L）和磺胺吡啶（2mmol/L）处理组细胞核NF-?B P65的表达与TNF-α处理组之间无统计学差异（P>0.05）。7、正常对照组NF-κB P65主要在细胞浆表达,少量在胞核表达,TNF-α处理组NF-κB P65几乎都在细胞核表达,柳氮磺胺吡啶组NF-κB P65细胞核几乎不表达;柳氮磺胺吡啶+TNF-α处理组较TNF-α处理组NF-κB P65细胞核表达明显减弱。结论:1、柳氮磺胺吡啶能够选择性抑制肝星状细胞增殖并诱导其凋亡;其分解产物5-氨基水杨酸和磺胺吡啶对肝星状细胞增殖和凋亡无明显影响。2、柳氮磺胺吡啶诱导HSC-T6凋亡的同时伴有磷酸化IKKα、磷酸化IκBα蛋白以及胞核内NF-κB P65蛋白表达的减少,提示柳氮磺胺吡啶可能通过抑制Rel/NF-?B/I?B/IKK信号通路诱导HSCs凋亡。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 柳氮磺胺吡啶对HSC-T6及L02细胞株增殖与凋亡的对比研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 柳氮磺胺吡啶诱导HSC-T6 细胞株凋亡的可能机制
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间完成的论文