论文摘要
目的:目前我国肾脏疾病,尤其是糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）的发病率不断上升。DN是糖尿病患者最严重的并发症之一,其发展至晚期往往会导致终末期肾功能衰竭,严重威胁人类的健康。DN的发病机制非常复杂,涉及到遗传、代谢、生长因子、细胞因子等多种因素。随着研究的不断深入,人们发现肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）可能为参与糖尿病肾病发生、发展的一个不可忽视的关键性细胞因子。在DN动物模型和DN患者中,TNF-α的表达水平均有升高,提示TNF-α参与了DN的发生与发展。TNF-α由157个氨基酸构成,除造血细胞外,肾脏固有细胞（主要是系膜细胞、肾小球细胞和肾小管上皮细胞等）也可产生TNF-α。TNF-α具有广泛的生物学活性,与细胞的分化、增殖及凋亡有关。有实验表明,TNF-α可以诱导负鼠肾脏近端肾小管上皮细胞发生凋亡。但有关TNF-α能否诱导人肾近端肾小管上皮细胞发生凋亡的研究却鲜见报道。Janus激酶/转录激活因子（ janus kinases/signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT）信号途径是细胞因子信号转导的重要通路之一,在肾脏疾病的发生发展中起重要作用。STAT是JAK激酶的底物,与酪氨酸磷酸化信号通路耦联,从而发挥转录调控作用。细胞因子信号转导抑制蛋白（suppressors of cytokine signaling,SOCS）家族是一类由细胞产生、可反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子,其对JAK/STAT信号通路起负调控作用。SOCS可能通过抑制JAK/STAT信号对DN发挥保护作用。现在尽管已经证实TNF-α诱导的细胞凋亡与JNK及NF-κB两条细胞信号转导通路密切相关,但对于JAK/STAT信号通路是否也在其中发挥一定的作用以及SOCS-1干预后能否抑制TNF-α诱导的细胞凋亡等问题却知之甚少。因此,本实验着重观察了TNF-α对人肾近端肾小管上皮细胞（HKC）凋亡和JAK/STAT信号激活的影响以及JAK/STAT信号特异性阻断剂（AG490）和SOCS-1过表达对TNF-α诱导细胞凋亡和JAK/STAT通路的影响。初步探讨TNF-α诱导HKC凋亡及凋亡过程中JAK/STAT信号通路的激活和SOCS-1基因的作用等问题,以期为DN的防治提供新的依据和策略。方法:1材料:人肾近端肾小管上皮细胞株HKC;pCR3.1-SOCS-1稳定转染人肾近端肾小管上皮细胞细胞系;pCR3.1-vector空质粒稳定转染人肾近端肾小管上皮细胞细胞系;TNF-α;AG490。2方法:2.1用甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定HKC细胞株的增殖情况,以确定TNF-α的半数抑制浓度（IC50）:设立空白对照组（control）、溶剂对照组（solvent）、药物组;药物浓度为5 ng.ml-1,10 ng.ml-1,20 ng.ml-1,40 ng.ml-1,80 ng.ml-1, 160 ng.ml-1。作用时间:24 h,测定IOD值,计算细胞生长抑制率,根据公式确定IC50,作为本实验中TNF-α的刺激浓度。2.2实验分组:实验细胞分成5组,分别为:对照组（N）; TNF-α组（T）; TNF-α+ AG490组（T+A）; TNF-α+ pCR3.1-SOCS-1转染组（T+S1）; TNF-α+ pCR3.1-vector空质粒转染组（T+V）;分别经细胞同步化、分组干预及刺激后收集细胞,进行观察检测。2.3检测指标:2.3.1流式细胞定量检测技术（flow cytometry, FCM）检测各组细胞凋亡率。2.3.2琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis, DNA Ladder）检测细胞凋亡。2.3.3末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸-生物素缺口末端标记法（terminal deoxynucleotide transferase-mediated deoxyuridine triphosphate -biotin nick-end labeling, TUNEL）检测各组细胞凋亡率。2.3.4应用蛋白免疫印迹（Western Blot）方法检测各组细胞p-STAT1、p-JAK2蛋白的表达情况。结果:1 TNF-α对HKC细胞株增殖的影响MTT法测定显示:TNF-α作用于HKC细胞24 h, IC50为18.59ng. mL-1。TNF-α对HKC细胞的增殖有抑制作用,并且随着药物浓度的升高,抑制作用逐渐增强。当药物浓度达到160 ng. mL-1时,TNF-α的抑制率接近80%。溶剂对细胞的生长未见明显影响。2 TNF-α诱导HKC凋亡及其对p-STAT1、p-JAK2蛋白表达的影响FCM、DNA Ladder、TUNEL等检测显示:与对照组相比,TNF-α刺激HKC 6 h后凋亡率显著增加,12 h达到高峰,之后逐渐回落,但仍高于对照组（P<0.05）。Western Blot结果表明,与对照组相比,TNF-α刺激后HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白表达升高,以刺激12 h时表达最高,而后回落,但仍高于对照组（P<0.05）。3 AG490对TNF-α诱导的HKC凋亡和p-STAT1、p-JAK2蛋白表达的影响FCM、DNA Ladder、TUNEL等结果显示:与同期T组相比,T+A组的凋亡率显著下降（P<0.05）,但仍高于对照组（P<0.05）。Western Blot结果表明,与同期T组相比,T+A组p-STAT1、p-JAK2蛋白的表达显著降低（P<0.05）,但仍高于对照组（P<0.05）。4 SOCS-1过表达对TNF-α诱导的HKC凋亡和p-STAT1、p-JAK2蛋白表达的影响FCM、DNA Ladder、TUNEL等结果显示:与同期T组相比,T+V组的凋亡率无明显差异,而T+S1组的凋亡率则显著下降（P<0.05）,但仍高于对照组（P<0.05）。Western Blot显示:与同期T组相比,T+S1组p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达降低（P<0.05）,T+V组两种蛋白的表达与T组相比无显著差异。结论:1 TNF-α对HKC生长的抑制作用呈剂量依赖性,并可诱导其凋亡。经TNF-α作用后,HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达水平升高。AG490干预后能抑制TNF-α诱导的HKC凋亡,并下调HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达水平,提示JAK/STAT信号途径可能参与了TNF-α诱导的HKC凋亡。2过表达SOCS-1基因能抑制TNF-α诱导的HKC凋亡及p-STAT1和p-JAK2蛋白的表达,提示SOCS-1基因可能通过对JAK/STAT信号途径的负反馈作用抑制TNF-α诱导的HKC凋亡。