两种水产动物抗菌肽的重组表达工艺优化与药理药效研究

论文摘要

本论文前期研究基础为:已成功构建了中华绒螯蟹抗脂多糖因子的大肠杆菌表达体系与中国明对虾对虾素3-2的毕赤酵母表达体系。在此基础上本论文建立了适宜的抗菌肽活性检测体系;完成了对抗脂多糖因子发酵培养基与培养条件的优化以及毕赤酵母部分摇瓶表达条件的优化研究,在此基础上进行了两种抗菌肽20L发酵罐的放大实验;通过在吉富罗非鱼饲料中添加不同剂量对虾素3-2以及抗生素,比较各试验组鱼的生长性能、生理生化指标、肠道菌群以及组织结构等的差异,以便深化抗菌肽作用机理研究,包括其药理药效和安全性等,探索其作为新型水产饲料添加剂的可行性,为抗菌肽的大面积推广应用提供试验数据和理论依据。现将主要结果介绍如下:1.重组大肠杆菌表达抗脂多糖因子的最佳培养基组成为（g/L）:10g/L酵母提取物,15.0g/L K2HPO4.12H2O,1.89g/L KH2PO4,10g/L NaCl,3.176g/L（NH4）SO4,3.75g/L蔗糖,3 mmol/L MgSO4,0.1 mmol/L CaCl2;最佳培养条件为:诱导起始的OD600为0.8,IPTG浓度0.5mM,诱导温度32.7℃,持续诱导4h。优化后的目的蛋白产量是优化前的2.16倍;重组蛋白有抑制藤黄微球菌的活性。参照优化后的培养基以及培养条件进行高密度发酵,发酵到第38h,菌体湿重达到109g/L,目的蛋白占总可溶性蛋白的10.5%。2.摇瓶条件下优化后的重组毕赤酵母表达对虾素3-2的培养条件为:初始培养基pH为5.0、诱导温度为28℃、持续诱导96h、在诱导培养基中加入10g/L的酸水解酪蛋白。参照优化后的培养条件进行高密度发酵,同时比较两种不同的甲醇流加方式,发现甲醇诱导时期限制性地流加甘油更适宜表达外源蛋白。重组蛋白对革兰氏阳性菌与阴性菌均有抑制作用。3.饲料中添加5mg/kg10mg/kg重组对虾素3-2可以显著提高吉富罗非鱼的增重率、红细胞总数以及过氧化氢酶的活性;100mg/kg氟苯尼考添加组与对照组相比红细胞总数显著升高;当添加50mg/kg对虾素3-2时,大部分肝细胞透亮,呈空泡,毛细血管充血,并且肝脏的超氧化物歧化酶和血清中的溶菌酶活性显著降低;各组肠道内大肠杆菌与乳酸菌的数量无显著差异;对罗非鱼进行嗜水气单胞菌的注射攻毒后,发现5mg/kg20mg/kg的死亡率较对照组显著降低,其余组与对照组无显著差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 抗菌肽的定义
• 1.3 抗菌肽的分类
• 1.4 抗菌肽的结构与理化特性
• 1.5 抗菌肽的选择毒性
• 1.6 抗菌肽的抑菌作用机理
• 1.7 抗菌肽的免疫调节作用
• 1.8 抗菌肽的优势
• 1.9 抗菌肽的应用进展
• 1.9.1 抗菌肽在临床上的应用
• 1.9.2 抗菌肽在食品工业中的应用
• 1.9.3 抗菌肽在水产养殖中的应用
• 1.9.4 抗菌肽在畜牧中的应用
• 1.10 抗脂多糖因子
• 1.11 对虾素penaeidin
• 1.12 高密度发酵
• 1.12.1 大肠杆菌的高密度发酵
• 1.12.2 毕赤酵母的高密度发酵
• 第二章 抗菌肽活性检测平台的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 指示菌种
• 2.2.2 抗菌肽
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 培养基与溶液
• 2.2.5 抗菌肽活性检测方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 液体检测法
• 2.3.2 固体检测法
• 2.4 讨论
• 第三章 中华绒螯蟹抗脂多糖因子高密度发酵研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 培养基与溶液
• 3.2.4 培养方法
• 3.2.5 实验设计
• 3.2.6 分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 种子培养基的选择
• 3.3.2 发酵培养基的优化
• 3.3.3 培养条件的优化
• 3.3.4 总验证实验
• 3.3.5 重组蛋白的纯化与活性检测
• 3.3.6 大肠杆菌的高密度发酵
• 3.4 讨论
• 第四章 重组基因工程毕赤酵母高密度发酵研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验菌种
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 培养基与溶液
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.5 分析方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 环境条件对毕赤酵母生长与重组蛋白活性的影响
• 4.3.2 毕赤酵母高密度发酵
• 4.3.3 重组对虾素的活性
• 4.4 讨论
• 4.4.1 培养基初始pH值对产量的影响
• 4.4.2 诱导温度对产量的影响
• 4.4.3 诱导周期对产量的影响
• 4.4.4 蛋白酶水解底物的加入对产量的影响
• 4.4.5 高密度发酵
• 第五章 饲料中添加重组抗菌肽对吉富罗非鱼生长、免疫、组织结构以及肠道菌群的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验仪器
• 5.2.2 培养基与常用溶液
• 5.2.3 重组抗菌肽、抗生素
• 5.2.4 实验饲料
• 5.2.5 实验动物与饲养管理
• 5.2.6 样品采集
• 5.2.7 测定指标与分析方法
• 5.2.8 攻毒实验
• 5.2.9 数据统计与分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 罗非鱼幼鱼的生长情况
• 5.3.2 罗非鱼幼鱼的生理生化指标
• 5.3.3 肠道菌群
• 5.3.4 罗非鱼幼鱼组织的形态结构显微观察
• 5.3.5 攻毒实验
• 5.4 讨论
• 5.4.1 饲料中添加抗菌肽对罗非鱼幼鱼增重率和特定生长率的影响
• 5.4.2 饲料中添加抗菌肽对罗非鱼幼鱼生理生化指标的影响
• 5.4.3 饲料中添加抗菌肽对肝脏中 CAT、SOD 活性以及血清中LZM活性的影响
• 5.4.4 饲料中添加抗菌肽对肠道菌群的影响
• 5.4.5 饲料中添加抗菌肽对组织显微结构的影响
• 5.4.6 饲料中添加抗菌肽对攻毒实验的影响
• 5.4.7 饲料中添加氟苯尼考与抗菌肽效果的比较
• 5.4.8 抗菌肽安全性评价
• 结论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 博士期间发表和完成的论文
• 致谢