论文摘要
降钙素（Calcitonins）是一类含有32个氨基酸残基的多肽激素,其主要作用是抑制骨吸收,降低血钙水平。不同种属的天然降钙素都包括了如下的结构特征:1)1,7位半胱氨酸形成的二硫键结构;2)C-末端的脯氨酰胺结构;3)8-22位的两性α-螺旋结构。天然降钙素中以鲑鱼降钙素（sCT）和鳗鱼降钙素（eCT）的活性较好,它们的合成类似物已在临床上用于治疗老年性骨质疏松症、Paget’s症、高血钙症及骨痛等疾病。天然降钙素在体内代谢稳定性较差,体内半衰期短（如sCT的半衰期为14min）。大量文献报道,以大分子聚合物对肽类及蛋白质类药物进行修饰,可提高其体内代谢稳定性。聚乙二醇（PEG）是一种较为广泛应用的大分子修饰剂,从1990年起,已有多种PEG修饰的蛋白质类药物上市。本论文旨在已有的线性降钙素研究基础上,设计合成新的线性sCT类似物,并对其进行定点的单PEG修饰,并从中寻找出生物活性高且代谢稳定性好的sCT类似物。根据文献提供的sCT体内/外代谢及构效关系研究结果,以及前期得到的高活性线性sCT类似物,从两个角度出发设计了系列新的sCT类似物:（1）序列较短且具有降钙活性的类似物;（2）通过PEG定位修饰得到稳定性更高,作用时间更长的降钙素类药物。主要设计思路包括:1)缺失19-22位氨基酸残基或更多氨基酸残基的类似物; 2)对高活性线性sCT类似物的易代谢位点或其附近的氨基酸以其它结构相似的氨基酸残基进行替换,或以半胱氨酸替换,并进行定点PEG修饰;3)对设计合成的线性鲑鱼降钙素类似物及其PEG修饰物进行降钙活性及其它相关生化指标的测定。总结构效关系,指导下一步的设计。根据以上的设计思路,共合成了氨基酸残基在20-32之间的sCT类似物12个。在肽序列的合成中,选用4-甲基二苯基甲胺树脂（MBHA）为固相载体,采用芴甲氧羰基（Fmoc-）保护策略,HOBt/DCC为缩合剂,由C-末端向N-末端延长肽链。氨基酸侧链功能团保护基以TFA脱除,以无水HF将肽链从树脂上裂解下来。均经反向高效液相色谱（RP-HPLC）纯化和基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的鉴定。PEG修饰剂可以针对肽链中不同的氨基酸残基侧链基团进行修饰:-NH2,-COOH,-SH等。PEG化反应中蛋白质或多肽上的反应官能团多呈亲核性,其亲核活性顺序:巯基>α-氨基>ε-氨基>羧基>羟基。多肽和蛋白质通常含有多个可进行PEG化的氨基及巯基,sCT中N-端α-氨基和Lys11、Lys18的ε-氨基均可同时发生PEG化。而利用巯基的高反应活性,在肽链易代谢位点或其附近引入一个Cys,并选取能够特异性与巯基偶联的PEG修饰剂mPEG-MAL,可实现对sCT的定点修饰。PEG修饰产物经RP-HPLC纯化和MALDI-TOF-MS鉴定。体内的降钙活性测定结果表明,线性sCT序列中的氨基酸残基以半胱氨酸替换后未见活性丧失,以D-Ala同时取代Cys1和Gly30后活性略有增强。初步长效研究发现,PEG修饰产物LK-YZ-101较sCT的作用时间有明显延长。本文设计合成了一系列新的线性鲑鱼降钙素类似物,并实现了单PEG的定点修饰,得到部分活性较高且作用时间延长的sCT类似物,为长效sCT类似物的进一步设计与研究奠定了基础。