论文摘要
[目的]家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterlolemia,FH）是一种常见的常染色体单基因显性遗传性疾病,是导致动脉粥样硬化和早发冠心病的最重要危险因素。本研究以临床确诊重型FH的2个汉族家系为实验对象,针对低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein-receptor,LDL-R）基因和FH新发现的致病基因蛋白转化酶---枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）基因,应用最新的毛细管电泳和新基因的微卫星位点,进行连锁分析,对候选基因进行核苷酸序列分析,最终发现突变,旨在建立一种快速的初筛方法,进而在汉族FH家系中进行基因定位,为FH人群的早期诊断和干预、预防冠心病和未来的基因治疗积累经验。[方法]本研究主要分为三部分:1.根据荷兰脂质临床指南（Dutch Lipid Clinic Network） 1999年制定的临床诊断FH标准入选FH家系,进行家系采集工作,对先证者进行心电图、颈动脉超声、超声心动图及腺苷负荷试验,和冠脉血流储备情况的相关检查,对所有家系成员进行血脂检查和家族史调查,所有成员签署知情同意书。根据家系采集的结果和临床检查的结果,绘制家系图,进行遗传学分析,为家系连锁分析作准备。2.配置细胞裂解液,采用酚-氯仿法从所有家系成员全血中提取基因组DNA。首先常规检测2名先证者ApoB100基因包括Q3500R、R3531C和R3501W位点在内的片段是否存在突变,以排除患家族性ApoB100缺陷症的可能性。然后对所有家系成员的DNA进行定量检测浓度,针对LDL-R基因和新的致病基因PCSK9,采用聚合酶链式反应扩增选择的微卫星位点,并对扩增产物进行纯化,应用新型毛细管电泳进行连锁分析,根据LOD值初步确定患者的易感基因。3.参照我室建立的Touchdown PCR方法扩增LDL-R基因全部18个外显子和17个内含子;参照国外文献（Steve E,Med Genet.2006）扩增PCSK9基因全部12个外显子;琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物片断,并送交上海生工生物公司和上海基康技术有限公司,对产物进行核苷酸序列分析,与GenBank比对分析突变位点和性质,从而早期基因诊断患者。[结果]本研究的结果也分为三部分:1.根据Dutch Lipid Clinic Network1999年制定的临床诊断FH标准入选了2个河南FH家系,共83人。其中河南1号家系中血脂异常者共11人,先证者同胞兄弟14岁时死于“黄瘤病”。先证者心电图示电轴左偏,左心室高电压,V3-V5ST段下斜性压低;超声心动图可见左室扩大,二尖瓣关闭不全（中度）;腺苷负荷试验阳性;冠脉血流储备减低。B超显示双侧颈动脉、双侧椎动脉起始段内膜弥漫增厚;右锁骨下动脉起始处斑块。河南2号家系中血脂异常者共16人,先证者表姨妈15岁时死于心肌梗死。先证者心电图显示窦性心律,无明显ST-T改变,大致正常心电图。超声心动图可见左室大,二尖瓣轻度返流,未见瓣膜钙化;腺苷负荷试验及冠脉血流储备未见异常。B超显示双侧颈动脉、双侧椎动脉起始段内膜弥漫增厚。2.经检测2名先证者均可排除患家族性ApoB100缺陷症的可能性。连锁分析发现河南1号先证者的致病基因与LDL-R基因连锁,可能与PCSK9基因连锁,但可能性很小。河南2号先证者致病基因与LDL-R基因和PCSK9基因均不连锁。3.核苷酸序列分析发现河南1号先证者LDL-R基因第2外显子发生Q12X突变,第97位碱基C→T改变,氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子,为杂合终止突变。其父亲,大姑,四姑,五姑也发现同样突变。经检索英国FH突变数据库（www.ucl.ac.uk/fh）,该突变在意大利,法国,土耳其人种已有报道,但在中国未见报道。故认为河南1号先证者的LDL-R基因发生的Q12X突变是中国一例新的突变,由于是终止突变,因此也是致病性突变。河南2号家系先证者经核苷酸序列分析,并未发现已知基因突变,我们推测可能存在其他未知的致病基因。[结论]1.两名先证者均符合FH的临床诊断,动脉硬化程度严重。2.两名患者ApoB100基因包括Q3500R、R3531C和R3501W位点在内的片段未见突变,可排除患家族性ApoB100缺陷症可能性。3.河南1号家系:连锁分析发现其致病基因与LDL-R基因连锁,可能与PCSK9基因连锁;核苷酸序列分析发现LDL-R基因第2外显子97位点C→T杂合终止突变（Q12X）,并且在其父亲和姑姑们中均发现该突变,Q12X为中国新的突变,且为致病性突变,暂未发现PCSK9基因突变;该先证者可能由于LDL-R基因致病突变,从而引发胆固醇极度增高,进而导致As,最终发生冠心病。4.河南2号家系:连锁分析和核苷酸序列分析均未发现已知基因突变,推测可能存在新的致病基因,这一点有待我们进一步探讨。5.应用新型毛细管电泳和新基因微卫星位点,成功建立了连锁分析初筛候选基因简单易行的方法。
论文目录
相关论文文献
标签：家族性高胆固醇血症论文; 连锁分析论文; 微卫星论文; 基因突变论文;