GPMV M基因的克隆及其主要抗原位点的原核表达

论文摘要

鹅副粘病毒（GPMV）为副粘病毒科,副粘病毒亚科,腮腺炎病毒属禽副粘病毒Ⅰ型（APMV-1）中的成员,引起鹅副粘病毒病。该病自1997 年由扬州大学王永坤教授报道以来,在国内很多地区流行。鹅副粘病毒病是以消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染病,给这些地区的养鹅业造成了巨大的经济损失。初步试验表明,GPMV 与传统的NDV 的致病性不同,并且常规的NDV 疫苗不能提供有效的保护。因此从分子生物学水平上对该病进行研究具有重要的意义。本研究根据Genbank 中发表的GPMV SF02 株及其它NDV 全基因序列,借助Oligo4.1 软件,设计2 对引物,采用RT-巢式PCR 方法对鹅副粘病毒JS/1/97/Go 株的M 基因进行了体外扩增,扩增出与预期大小相符的M 基因的特异性条带。将扩增出的DNA 片断克隆到pMD18-T载体中,转化TG1 感受态细胞,经AMP/IPTG/X-gal 平板筛选,酶切和PCR 鉴定后获得阳性重组质粒。序列测定表明:M 基因全长1095bp,含有一个完整的开放阅读框架,编码365 个氨基酸残基,与参考序列比较,核苷酸的同源性为84.8%～98.9%。研究资料表明GPMV M 基因5,端长444bp 的特异片断主要决定其活性,据此又设计合成一对引物,克隆M 基因5,端1bp-444bp,命名为M 基因主要抗原位点片断（M1）。将M 基因主要抗原位点片断（M1）同载体PGEX-6P-1 连接后,转化入E.Coli. BL21（DE3）PlysS,经IPTG 诱导表达出目标蛋白,与预计相符。对表达的蛋白进行Western blot分析,证实所表达的融合蛋白有较好的反应原性。本研究在国内首次克隆了GPMV/JS/1/97/Go 株的M 基因,并获得了M 主要抗原位点基因的表达,为进一步建立GPMV 免疫学诊断提供了重要的物质基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 流行病学、临床症状及防疫措施
• 1.2 GPMV 生物学特性
• 1.3 GPMV 的主要分子生物学特征
• 1.3.1 F 蛋白及其基因的分子生物学
• 1.3.2 HN 蛋白及其基因的分子生物学
• 1.3.3 M 蛋白及其基因的分子生物学
• 1.3.4 GPMV 的其它蛋白
• 1.4 鹅副粘病毒病与NDV 的关系
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 质粒与菌种
• 2.1.3 扩增引物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 GPMV 增殖与初步纯化
• 2.2.2 GPMV 总RNA 的提取
• 2.2.3 反转录合成cDNA
• 2.2.4 GPMV M 和M1 基因的克隆与序列分析
• 2.2.5 GPMV M 和M1 基因重组表达载体的构建
• 2.2.6 GPMV M1 基因在原核系统中的表达
• 2.2.7 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3 实验结果
• 3.1 GPMV M 和M1 基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 GPMV M 和M1 基因的PCR 扩增
• 3.1.2 重组质粒pMD18-T-M、pMD18-T-M1 的鉴定
• 3.1.3 GPMV M、M1 基因的测序结果及同源性比较
• 3.2 GPMV M、M1 基因重组表达载体的鉴定
• 3.2.1 重组质粒pGEX-6P-M、pGEX-6P-M1 的鉴定
• 3.2.2 重组质粒pProEXHTb-M 的鉴定
• 3.2.3 重组质粒pET-30a（+）-M 的鉴定
• 3.3 GPMV M1 基因在大肠杆菌中的表达
• 3.3.1 M1 基因表达产物的SDS-PAGE 检测
• 3.3.2 M1 基因表达产物的Western-blot 检测
• 4 讨论
• 4.1 GPMV M 基因的克隆与序列分析
• 4.2 GPMV M 和M1 基因原核表达系统的选择
• 4.3 GPMV M1 基因的原核表达
• 4.4 Western-blot 结果分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文