南海海洋微生物宏基因组文库中酯酶基因的筛选与鉴定

论文摘要

自然环境中99%的微生物在目前的试验条件不易获得纯培养,极大限制了人类对微生物遗传资源的有效利用。现代生物科技以及严峻的能源危机对新型工业用酶的需求日益旺盛,极大的促进了新型开发环境遗传资源技术手段的发展。宏基因组学不依赖于微生物培养,提供了一个获取宝贵未培养微生物遗传资源的途径。在本研究中,采用宏基因组学的方法构建了一个高质量的南海海洋微生物宏基因组文库,通过高通量功能筛选,获得了五个酯酶阳性克隆,对其中两个具有较高活力的阳性克隆进行亚克隆,通过测序鉴定了酯酶的编码基因并分别命名为EstA和EstB,各自编码一个277和328个氨基酸的蛋白。氨基酸序列比对和分子进化树分析表明,EstA和在进化树上相近的可能具酯类水解活力蛋白形成一个家族,并与脂肪酶/酯酶FamilyⅢ相近,EstB和在进化树上相近的脂肪酶/酯酶形成了脂肪酶/酯酶FamilyⅣ的亚家族。定点突变试验表明EstA含有一个经典的催化三亚基结构（S146-D222-H255）,而EstB含有一个不寻常的催化三亚基,由S149-E243-H273组成,这个特殊的催化三亚基构成这个亚家族的一个重要特征。异源表达纯化蛋白后,对EstA和EstB分别进行了酶学性质分析,结果表明EstA在多种阳离子中和高浓度的NaCl中表现出高度稳定性,反应了取样环境的高盐多离子的特征。EstB活力不受PMSF抑制,表明EstB可能具有一个类似于脂肪酶的lid结构。另外,EstB对对硝基苯酚酯类底物具有很高的催化活力,并且在30%的甲醇、乙醇、DMF、DMSO等有机溶剂中高度稳定,使得EstB成为一极具应用潜力的酯酶。从环境中发掘重要的工业用酶用于工业应用,有利于节约原材料、节省能源,对于促进工业化发展和经济增长具有重要意义,同时也为开发海洋微生物的其它重要功能基因提供有力借鉴,为寻求海洋微生物资源最大限度挖掘、可持续开发利用的科学途径奠定理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1 海洋微生物
• 1.1 引言
• 1.2 微生物多样性及其研究方案
• 1.2.1 微生物的纯培养
• 1.2.2 磷脂脂肪酸分析
• 1.2.3 生理学的方法—Biolog微孔板法
• 1.2.4 分子生物学方法
• 1.3 海洋微生物多样性、不可培养性
• 1.4 海洋微生物的特殊性
• 1.5 研究开发海洋微生物的意义
• 1.5.1 从海洋微生物开发工业用酶
• 1.5.2 海洋生物活性物质
• 1.5.3 新型功能基因
• 1.5.4 新种属微生物的重要来源
• 1.5.5 保护海洋生态环境
• 1.5.6 其它
• 2 宏基因组学
• 2.1 引言
• 2.2 宏基因组文库的载体
• 2.3 宏基因组文库的宿主
• 2.4 宏基因组文库的筛选
• 2.4.1 序列的筛选方法
• 2.4.2 功能筛选方法
• 2.4.3 底物诱导基因表达法
• 2.5 宏基因组文库的应用
• 2.5.1 新功能基因的发现
• 2.5.2 开发新型生物活性物质
• 2.5.3 环境微生物群落结构分析
• 2.5.4 微生物的多样性
• 2.5.5 对人类健康的贡献
• 2.5.6 开发重要的工业用酶
• 3 酯酶概述
• 3.1 引言
• 3.2 酯酶/脂肪酶分类
• 3.3 酯酶的应用
• 3.2.1 食品加工
• 3.2.2 农业
• 3.2.3 制药工业
• 3.2.4 制浆造纸、纺织品、皮革处理以及烘焙工业
• 3.2.5 洗涤添加剂方面
• 3.4 酯酶/脂肪酶的三级结构
• 3.5 酯酶催化机理
• 3.6 酯酶的定向进化
• 4 立题依据和意义
• 4.1 本课题的研究意义
• 4.2 本课题研究的技术路线
• 第二章 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶及生化试剂
• 1.3 耗材类
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 母液及培养基的配制
• 1.5.1 LB培养基
• 1.5.2 SOC培养基
• 1.5.3 BAC文库保存培养基
• 1.5.4 10%PEG8000
• 2 实验方法
• 2.1 宏基因组构建
• 2.1.1 BAC质粒抽提
• 2.1.2 脉冲场凝胶电泳分离基因组DNA
• 2.1.3 制备大肠杆菌电击感受态细胞
• 2.1.4 透析袋的处理
• 2.1.5 南海海表采样收集微生物菌体
• 2.1.6 HMW基因组DNA制备
• 2.1.7 电洗脱回收基因组DNA
• 2.1.8 基因组DNA的浓缩
• 2.1.9 HMW基因组DNA的部分酶切与大量制备
• 2.1.10 HMW基因组DNA的连接转化
• 2.1.11 BAC文库质粒RFLP鉴定
• 2.1.12 BAC文库质粒插入片段大小分析
• 2.1.13 宏基因组文库的挑取与保存
• 2.2 酯酶活性筛选、异源表达及酯酶活性测定
• 2.2.1 BAC文库酯酶活性克隆筛选
• 2.2.2 BAC质粒亚克隆
• 2.2.3 EstA酯酶异源表达质粒构建
• 2.2.4 EstB酯酶异源表达质粒构建
• 2.2.5 蛋白表达与纯化
• 2.2.6 EstA酯酶比活力测定
• 2.2.7 EstB酯酶比活力测定
• 2.2.8 酯酶最适温度测定
• 2.2.9 酯酶最适pH测定
• 2.2.10 有机溶剂、金属离子、EDTA、NaCl对酯酶活性的影响
• 2.2.11 氨基酸残基定点突变
• 2.2.12 引物序列
• 第三章 宏基因组文库构建
• 1 实验结果与分析
• 1.1 海洋微生物菌体收集
• 1.2 海洋微生物HMW基因组DNA制备
• 1.3 海洋微生物HMW基因组的部分酶切
• 1.4 制备大量制备部分酶切的HMW基因组DNA
• 1.5 HMW基因组DNA的连接转化
• 2 讨论
• 第四章 酯酶筛选与鉴定
• 1 宏基因组文库酯酶筛选
• 1.1 海洋微生物宏基因组文库中酯酶和淀粉酶活性的高通量筛选
• 1.2 具有酯酶活性质粒的亚克隆
• 2 酯酶基因序列比对、分子进化树分析
• 2.1 酯酶编码基因的鉴定
• 2.2 EstA和EstB同源基因分析
• 2.3 EstA和EstB的分子进化树分析
• 2.4 EstA和EstB氨基酸序列同源比对
• 3 酯酶的纯化与鉴定
• 3.1 酯酶基因的过表达
• 3.2 EstA和EstB的底物范围和比活力
• 3.3 EstA和EstB活性位点氨基酸定点突变
• 3.4 热稳定性,温度、pH对EstA和EstB活力的影响
• 3.5 有机溶剂、阳离子、PMSF、NaCl对EstA和EstB活性的影响。
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果
• 致谢